郁大偉 宋華峰 邱文娜 薛婧 酈芳華 胥萍

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，新發(fā)結(jié)核病患者中，有10.2%的患者會(huì)出現(xiàn)對(duì)至少一種抗結(jié)核藥物耐藥[1]。中國(guó)每年新增耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者約12萬(wàn)例，其傳染性更強(qiáng)、治愈率更低，病死率更高，因此，如何更早、更高效地發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者、尤其是MDR-TB患者，成為了控制耐藥結(jié)核病傳播的關(guān)鍵[2]。目前，臨床上常用的一線抗結(jié)核藥品為異煙肼、利福平、乙胺丁醇及鏈霉素，與其他抗結(jié)核藥品相比，利福平單耐藥的發(fā)生率較低，可把利福平耐藥作為診斷MDR-TB的指征[3]。目前檢測(cè)耐藥結(jié)核病的方法中，傳統(tǒng)的BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“MGIT 960”)及改良羅氏藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果雖準(zhǔn)確可靠，但檢測(cè)周期長(zhǎng)，易造成診斷延誤。亟需尋求能夠快速、準(zhǔn)確、安全的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌(MTB)及其耐藥性的分子診斷技術(shù)。筆者對(duì)GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“GeneXpert”)檢測(cè)痰標(biāo)本中MTB及其耐藥性的效能進(jìn)行分析與探討。

資料和方法

1.研究材料：收集2018年1—12月蘇州市第五人民醫(yī)院收治的疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本414份。痰標(biāo)本由患者按要求自行采集，留痰前先用清水漱口，從肺部深處用力咳出痰液，收集于一次性無(wú)菌痰瓶之中，痰液量約3～5 ml。分別采用GeneXpert和MGIT 960技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

2.儀器與試劑：GeneXpert試劑盒(美國(guó)Cepheid公司)，GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Cepheid公司)；MGIT 960培養(yǎng)管(美國(guó)BD公司)，MTB快速培養(yǎng)系統(tǒng)(美國(guó)BD公司)，分枝桿菌羅氏培養(yǎng)管(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

3.痰涂片抗酸染色：采用珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的抗酸染色液試劑盒，按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[4]中的檢測(cè)要求和操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

4.MTB培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)：將痰瓶中痰液轉(zhuǎn)移1～2 ml至50 ml離心管中，加入等體積的4%氫氧化納(NaOH)進(jìn)行充分液化，漩渦振蕩、混勻，靜置30 min，加入40 ml pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)中和、離心，棄上清。在棄去上清的離心管中加入0.5 ml生理鹽水，吹打、混勻。吸取 0.5 ml標(biāo)本加入MGIT 960培養(yǎng)管中，將接種好的培養(yǎng)管放入儀器中進(jìn)行培養(yǎng)。MGIT 960培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后，挑取生長(zhǎng)良好的菌落，與磨菌管底部的PBS緩沖液混合均勻，配備不同濃度的菌懸液。用接種環(huán)沾取1滿環(huán)約為0.01 ml不同稀釋倍數(shù)的菌懸液，用劃線法均勻涂布于各培養(yǎng)基表面。37 ℃培養(yǎng)，至4周報(bào)告結(jié)果。若藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)管上有菌落生長(zhǎng)則在4周內(nèi)可報(bào)告結(jié)果；若4周內(nèi)對(duì)照培養(yǎng)管上長(zhǎng)滿菌落而藥敏試驗(yàn)培養(yǎng)管內(nèi)無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，不能輕易報(bào)告“敏感”，因耐藥菌常較敏感菌生長(zhǎng)緩慢，故需延長(zhǎng)培養(yǎng)約1～2周，再觀察結(jié)果。

5.GeneXpert檢測(cè)：痰液標(biāo)本加入2倍樣本體積的樣本處理液進(jìn)行液化，擰緊瓶蓋，漩渦振蕩至少20 s，將混勻后的樣本于室溫下靜置15 min；用無(wú)菌移液管吸取液化的樣品，直至彎月面在移液管的最低標(biāo)記之上(注意避免形成氣溶膠)，由檢測(cè)匣的加樣孔緩慢加入，蓋上檢測(cè)匣蓋子，上機(jī)檢測(cè)。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以“率(%)”表示，組間差異的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以痰培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照，計(jì)算GeneXpert的檢測(cè)效能指標(biāo)，各項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算方法：敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；符合率=(真陽(yáng)性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總檢測(cè)人數(shù)×100%。一致性檢驗(yàn)采用Kappa檢驗(yàn)，即：Kappa值≥0.75為一致性較好；0.40≤Kappa值<0.75為一致性一般；Kappa值<0.40為一致性較差。

結(jié) 果

1.痰標(biāo)本陽(yáng)性檢出情況：通過(guò)檢測(cè)414份痰標(biāo)本，痰涂片陽(yáng)性檢出率為18.6%(77/414)，MGIT 960培養(yǎng)的陽(yáng)性檢出率為31.4%(130/414)，GeneXpert檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率為35.3%(146/414)。GeneXpert和MGIT 960培養(yǎng)的陽(yáng)性檢出率明顯高于痰涂片(χ2=29.22，18.09，P值均<0.001)，而GeneXpert的陽(yáng)性檢出率與MGIT 960培養(yǎng)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.39，P=0.238)。

表1 GeneXpert檢測(cè)以MGIT 960藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照檢測(cè)MTB利福平耐藥的效能分析

2.耐藥檢測(cè)情況：GeneXpert檢出的146份陽(yáng)性標(biāo)本中利福平耐藥檢出率為9.6%(14/146)，MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性的130份痰標(biāo)本中利福平耐藥檢出率為9.2%(12/130)，兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.01，P=0.919)。

3.耐藥檢測(cè)效能評(píng)價(jià)：99份痰標(biāo)本同時(shí)具有GeneXpert檢測(cè)和MGIT 960培養(yǎng)的藥敏結(jié)果，以MGIT 960培養(yǎng)藥敏結(jié)果為參照，GeneXpert檢測(cè)MTB利福平耐藥的敏感度為81.8%、特異度為98.9%、符合率為97.0%、Kappa值為0.84，見(jiàn)表1。

討 論

隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的迅猛發(fā)展，PCR 等核酸擴(kuò)增技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中起著越來(lái)越關(guān)鍵的作用，這類檢測(cè)方法具有速度快、敏感度高、效率高等優(yōu)點(diǎn)，尤其對(duì)于結(jié)核病的早期診斷具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。但傳統(tǒng)的PCR操作過(guò)程較復(fù)雜、易出現(xiàn)交叉污染，而出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況，容易使臨床對(duì)患者的病情出現(xiàn)誤診[5]。此外，PCR 檢測(cè)對(duì)設(shè)備的要求高，對(duì)操作人員要求也比較高，需經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)技術(shù)的崗前培訓(xùn)。因此，將其在大多數(shù)基層醫(yī)院普及還需要一個(gè)過(guò)程。目前，隨著科技的不斷進(jìn)步，檢測(cè)設(shè)備及手段同步得到發(fā)展，GeneXpert檢測(cè)在全球的開(kāi)展及接受程度相當(dāng)廣泛和快速，是唯一受到WHO推薦的，用于MTB及利福平耐藥快速檢測(cè)的手段。該方法不易產(chǎn)生氣溶膠、不易污染、可檢測(cè)多種類型的樣本、報(bào)告周期短、敏感度高、特異度強(qiáng)，一般實(shí)驗(yàn)室條件均可滿足其要求[6-7]。

本研究結(jié)果顯示，與痰涂片結(jié)果相比，GeneXpert檢測(cè)和MGIT 960培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率明顯升高，但兩者之間沒(méi)有差異。進(jìn)一步分析耐藥檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GeneXpert檢測(cè)和MGIT 960培養(yǎng)對(duì)MTB利福平耐藥檢出率也沒(méi)有差異，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[8-9]。以MGIT 960培養(yǎng)藥敏檢測(cè)結(jié)果為參照，GeneXpert檢測(cè)MTB利福平耐藥的敏感度和特異度均較高，分別為81.8%和98.9%，且具有較好的一致性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10-12]。

綜上，本研究結(jié)果表明，GeneXpert在快速檢測(cè)MTB及利福平耐藥方面具有較好的效能。值得注意的是，由于該技術(shù)的檢測(cè)原理是基因擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增的模板是核酸，因此其檢測(cè)結(jié)果不能區(qū)分死菌和活菌。所以，在臨床檢測(cè)中會(huì)存在GeneXpert檢測(cè)陽(yáng)性而培養(yǎng)陰性的相互矛盾結(jié)果?？傮w而言，GeneXpert在早期篩查MTB及利福平耐藥時(shí)具有較好的效能，且檢測(cè)時(shí)間快，是一種快速、可靠的輔助診斷方法。