李紀順，陳凱，王貽蓮，李紅梅，唐永輝，魏艷麗，扈進冬，趙忠娟，楊合同

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)，山東省科學院生態(tài)研究所，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250103；2.榮成市農(nóng)業(yè)農(nóng)村事務服務中心，山東 榮成 264300)

西洋參PanaxquinquefoliumL.又名花旗參、洋參等，五加科人參屬植物，具有抗腫瘤、抗疲勞、抗心律失常、増強機體免疫力等多種功效，既是名貴上品中藥，又是高級滋補佳品[1-3]。西洋參原產(chǎn)于美國和加拿大，我國于20世紀70年代末期開始引種，主產(chǎn)區(qū)集中在東北、華北、華東的膠東半島和西北的漢中地區(qū)[4-5]。西洋參成藥周期一般為4年，忌地性極強，在生產(chǎn)上存在嚴重的連作障礙，其中土壤微生態(tài)失衡和土傳病害的泛濫是導致連作障礙的重要原因[6-8]。立枯病是西洋參苗期的主要病害，其病原菌為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，一般發(fā)病率在20%以上，嚴重地塊高達50%，甚至造成參苗成片死亡，目前主要的防治措施是化學藥劑防治，但容易造成農(nóng)藥污染以及病原菌產(chǎn)生耐藥性[9-10]。對西洋參真菌病害特別是苗期立枯病的生物防治研究報道較少，張愛華等[11]通過木霉30371菌劑和放線菌F05菌劑復配使用，使西洋參立枯病的防效達46%，使西洋參銹腐病的盆栽和田間相對防效分別達88.93%和44.57%，防治效果不理想。如何有效控制西洋參病害，提高產(chǎn)品品質(zhì)，保護生態(tài)環(huán)境，成為西洋參生產(chǎn)中亟需解決的問題。

木霉(Trichodermaspp.)是自然界廣泛分布的真菌，研究表明木霉具有多種生防機制，至少對18個屬20余種病原真菌和多種病原細菌有拮抗作用，可在多種逆境下生存和定殖，能夠有效利用環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)，抑制植物病害，促進植物生長和誘導植物系統(tǒng)抗性等。目前國際上有60多個國家使用100多種含有木霉菌成分的生物制劑產(chǎn)品[12-14]。不同木霉菌株的生防效果不同，故篩選高效廣譜的木霉菌株以及正確的施用方法至關重要[15]。

本實驗室一直從事木霉菌株的篩選與生物活性研究，前期已分離到多株木霉菌株，研究表明其對多種植物真菌病害具有較好的防治效果及抗逆增產(chǎn)功能[16-17]。本文在前期工作基礎上，通過抑菌實驗篩選高效抑制西洋參立枯病的木霉菌株，并在小區(qū)條件下進行防治效果評價，為病害防治及高效無毒微生物農(nóng)藥的推廣應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

生防木霉為實驗室前期篩選的10株效果較好的木霉菌株。病原真菌為西洋參立枯病菌(RhizoctoniasolaniKuehn)、西洋參黑斑病菌(AlternariapanaxWhetz)、西洋參疫病菌(Phytophthoracactorum)、西洋參猝倒病菌(PythiumdelaryanumHess)、西洋參灰霉病菌(Botrytiscinerea)、西洋參炭疽病菌(ColletotrichumpanacicolaUyeda et Takim)，由本實驗室分離自山東榮成西洋參感病植株。西洋參銹腐病菌(Cylindrocarpondestructans)ACCC39132及西洋參根腐病菌(Fusariumsolani)ACCC37121，購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

PDA(potato dextrose agar)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL。

SNA(synthetic low nutrient agar)培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g、KNO31.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、葡萄糖0.2 g、蔗糖0.2 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL。

CMD(corn meal dextrose)培養(yǎng)基：玉米粉30 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL。

西洋參種子：供試西洋參種子為自采。

化學藥劑：體積分數(shù)為2.5%的咯菌腈懸浮種衣劑、33.5 g/L精甲霜靈、25 g/L咯菌腈。

儀器：Fungal DNA Mini Kit試劑盒(Omega公司);Ta KaRaTaqTM聚合酶(寶生物工程(大連)有限公司)，CX31顯微鏡(Olympus公司);MyCycler PCR儀(Bio-Rad公司);GenoSens 1880凝膠成像分析系統(tǒng)(上海勤翔科學儀器有限公司)。

1.3 木霉與病原真菌的平板對峙培養(yǎng)實驗

利用對峙實驗篩選對立枯病菌抑制效果較好的木霉，并測定優(yōu)良木霉的抑菌譜。PDA平板直徑兩端距中心35 mm處分別接種直徑5 mm的木霉菌株和病原真菌，以只接種病原真菌為對照，25 ℃培養(yǎng)6 d，對于生長緩慢的病原真菌，預培養(yǎng)1～2 d后再接種木霉對峙培養(yǎng)，記錄病原真菌對峙方向生長半徑，計算抑制率(RI)。

(1)

其中r0為對照病菌生長半徑，r為與木霉對峙培養(yǎng)的病菌生長半徑。

1.4 木霉可濕性粉劑制備

通過對峙培養(yǎng)，篩選可用于小區(qū)試驗的木霉菌株。以硅藻土為載體，制備木霉的可濕性粉劑，制劑初始分生孢子量為2億/g，水分為5%～10%。

1.5 木霉制劑防治西洋參立枯病小區(qū)試驗

1.5.1 拌種處理

試驗時間為2015-10-30—2016-11-07，在山東省榮成市上莊鎮(zhèn)東上莊村西洋參種植地進行，該地塊上年立枯病發(fā)病率中等偏上。試驗設5個處理：CK(清水對照)；化學藥劑，體積分數(shù)為2.5%的咯菌腈懸浮種衣劑，10 mL稀釋為原濃度1/5后拌種2～3 kg西洋參種子；HB20111可濕性粉劑，200～300 g稀釋為原濃度1/5后拌種10 kg西洋參種子；QT21979可濕性粉劑，200～300 g稀釋為原濃度1/5后拌種10 kg西洋參種子；TW21990可濕性粉劑，200～300 g稀釋為原濃度1/5后拌種10 kg西洋參種子。小區(qū)面積10 m2，每小區(qū)播種數(shù)量一致的西洋參種子，設保護行，隨機分布，每處理設3個重復，常規(guī)管理。

西洋參完全出苗28 d后調(diào)查病株數(shù)，每次處理隨機抽取5行進行調(diào)查(每行播種26粒種子)，計算病株率(d)和防治效果(c)，如式(2)～(3)。于2016-10-20—2016-11-10期間挖出參苗，統(tǒng)計1年生西洋參的單株參鮮重和總參鮮重，計算單株參增重率(wgs)和總參增重率(wga)，如式(4)～(5)。

(2)

其中di為病株數(shù)，da為總調(diào)查株數(shù)。

(3)

其中d為處理組病株率，d0為對照組病株率。

(4)

其中ws為處理組單株參鮮重，ws0為對照組單株參鮮重。

(5)

其中wa為處理組總參鮮重，wa0為對照組總參鮮重。

1.5.2 蘸根處理

試驗期為2016-11-07—2017-10-11，在1.5.1試驗的基礎上，挖取1年生參苗，蘸根后移栽。試驗設5個處理：(Ⅰ)CK(清水對照)；(Ⅱ)化學藥劑對照，33.5 g/L精甲霜靈+25 g/L咯菌腈10 g兌水30 kg蘸根1 min；(Ⅲ)HB20111可濕性粉劑稀釋為原濃度的1/50蘸根10 min；(Ⅳ)QT21979可濕性粉劑稀釋為原濃度的1/50蘸根10 min；(Ⅴ)TW21990可濕性粉劑稀釋為原濃度的1/50蘸根10 min。小區(qū)面積5 m2，每小區(qū)移栽數(shù)量一致的西洋參幼苗，設保護行，隨機分布，每處理設3個重復，常規(guī)管理。

第2年移栽30～40 d后調(diào)查病株數(shù)，每次處理隨機抽取5行進行調(diào)查(每行移栽16株幼苗)，計算d和c。于2017-10-1—2017-10-11期間挖出參苗，統(tǒng)計2年生西洋參的單株參鮮重和總參鮮重，計算wgs和wga。計算公式同1.5.1。

1.6 木霉菌株鑒定

1.6.1 形態(tài)學觀察

分別在SNA、PDA和CMD平板上培養(yǎng)木霉菌株，定期觀察菌落形態(tài)及分生孢子梗、瓶梗的發(fā)育形態(tài)。

1.6.2 分子鑒定

利用Omega公司的Fungal DNA Mini Kit試劑盒提取木霉基因組DNA，用ITS(internal transcribed spacer)通用引物ITS1-F/ITS4進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物交上海生工生物股份有限公司進行測序，結果分別提交NCBI(national center for biotechnology information)[18]和ISTH(international subcommission onThrichodermaandHypocrea)[19]網(wǎng)站進行比對分析。選取NCBI上與目標菌株同源性較高的ITS序列，利用MEGA 5.0中的Upgma構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，自展數(shù)據(jù)集為1000次，分析其親緣關系。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本文數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件中的Duncan’s方法進行分析，結果為3次重復的平均值±標準差，以不同小寫字母表示各處理間在0.05水平上存在顯著性差異，以不同大寫字母表示各處理間在0.01水平上存在極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 木霉菌株對立枯絲核菌的抑制作用

供試木霉菌株在PDA平板上對R.solani均有一定的抑制作用，不同木霉菌株的抑制率不同。其中菌株HB20111的抑制效果最好，抑制率達99.33%，與其他菌株間存在極顯著性差異(P<0.01)，另外菌株QT21979和TW21990的抑制效果也達到了93.00%以上，效果稍低于HB20111，結果見圖1。下文將利用這3株木霉制備可濕性粉劑，進行西洋參立枯病的小區(qū)防治效果評價。

圖1 木霉菌株在PDA平板上對立枯絲核菌的抑制作用Fig.1 Inhibition ratio of Trichoderma spp. strains against R. solani on a PDA plate

2.2 木霉可濕性粉劑對西洋參立枯病的小區(qū)防治效果

2.2.1 拌種處理

木霉可濕性粉劑拌種處理結果見表1。木霉處理和化學包衣處理對西洋參立枯病均有一定的防治效果，不同處理的病株率不同。3種木霉制劑處理的病株率與清水對照間均存在極顯著性差異(P<0.01)。不同木霉處理與化學包衣間的差異不同，其中木霉QT21979效果比化學包衣差，木霉TW21990與化學包衣間無差異，木霉HB20111效果最好，與化學包衣處理間存在極顯著性差異(P<0.01)，拌種處理后防治效果達到了71.81%。

表1 木霉可濕性粉劑拌種處理對西洋參立枯病的小區(qū)防治效果

注：結果為3次重復的平均值±標準差

木霉可濕性粉劑對西洋參有促生長作用，3種木霉處理后的1年單株參鮮重與清水對照間均存在極顯著性差異(P<0.01)，其中HB20111和TW21990與化學包衣間也存在極顯著性差異(P<0.01)，單株參增重率分別達到了33.54%和24.63%。

3種木霉處理后的1年總參鮮重與清水對照間均存在極顯著性差異(P<0.01)，其中HB20111和TW21990與化學包衣處理間也存在極顯著性差異(P<0.01)，總參增重率分別達到了92.75%和68.97%。

2.2.2 蘸根處理對西洋參立枯病的小區(qū)防治效果

在2.2.1拌種處理的基礎上，繼續(xù)用木霉蘸根處理西洋參防治立枯病，結果見表2。各處理組的病株率與清水對照間存在極顯著性差異(P<0.01)，但木霉QT21979處理與化學包衣間無差異，木霉TW21990處理與化學包衣間存在顯著性差異(P<0.05)，木霉HB20111效果最好，與化學包衣間存在極顯著性差異(P<0.01)，蘸根處理后防治效果達到了91.04%。

表2 木霉可濕性粉劑蘸根處理對西洋參立枯病的小區(qū)防治效果

注: 結果為3次重復的平均值±標準差

3種木霉處理后的2年單株參鮮重與清水對照及化學包衣間均存在極顯著性差異(P<0.01)，其中HB20111效果最好，單株參增重率達到了158.06%。

3種木霉處理后的2年總參鮮重與清水對照及化學包衣間均存在極顯著性差異(P<0.01)，其中HB20111效果最好，總參增重率達到了1 369.34%。

2.3 木霉菌株HB20111的抑菌譜

將上述效果最好的木霉菌株HB20111進行抑菌譜檢測，結果見圖2。HB20111在PDA平板上對供試8種西洋參病原真菌均有拮抗作用，對不同病原真菌的抑制率間存在極顯著性差異(P<0.01)，其中對R.solani、F.solani、B.cinerea、P.delaryanum、C.panacicola抑制效果最好，25℃對峙培養(yǎng)6 d的抑制率均達到了98.5%以上。

圖2 木霉菌株HB20111的抑菌譜Fig.2 Antimicrobial spectrum of Trichoderma spp. strain HB20111

2.4 木霉菌株HB20111的種類鑒定

2.4.1 菌株形態(tài)學特征

對木霉菌株HB20111進行種類鑒定，該菌株采集自山東省濱州黃河濕地土壤，該地區(qū)經(jīng)度117.964°E，緯度32.292°N，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 16963。

圖3 木霉菌株HB20111的形態(tài)特征Fig. 3 Morphological characteristics of Trichoderma spp. strain HB20111

木霉菌株HB20111的形態(tài)特征見圖3，其中，圖3a～c為在不同培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d的菌落特征。菌株HB20111在SNA培養(yǎng)基上20、25、30、35 ℃培養(yǎng)72 h，菌落半徑分別為15.0～17.0 mm、26.0～28.5 mm、30.0～32.0 mm、2.5～4.0 mm，高于40 ℃不生長，最適生長溫度為25～30 ℃。在SNA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d，菌落表面氣生菌絲疏松，分生孢子綠色，產(chǎn)生鋸齒狀同心輪紋，邊緣有綠色產(chǎn)孢簇，基質(zhì)中無水溶性色素分布，菌落反面無色。

在PDA培養(yǎng)基上20、25、30、35 ℃培養(yǎng)72 h，菌落半徑分別為43.0～44.5 mm、56.5～58.5 mm、40.0～42.0 mm、2.0～3.5 mm，高于40 ℃不生長，最適生長溫度為25～30 ℃。在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d，菌落表面呈絲絨狀，邊界清晰，中央有一菌絲相對致密的圓盤狀結構，是分生孢子的主要產(chǎn)生區(qū)域，分生孢子綠色濃密，菌落反面白色，有椰香味氣體產(chǎn)生。

在CMD培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d，菌落表面呈粉塵顆粒狀，菌絲疏松、有兩圈綠色同心輪紋，菌落邊緣分布直徑為2.0～3.0 mm的產(chǎn)孢簇，分生孢子綠色，菌落反面白色，基質(zhì)中無水溶性色素產(chǎn)生，有椰子氣味。

分生孢子梗分枝特征與深綠木霉(T.atroviride)一致[20]，為典型的單側(cè)分枝，分枝角度近似90°，但也常見成對著生分枝。瓶梗長度(4.2～)6.0～9.7(～15.0) μm，長寬比例(1.1～)1.8～3.5(～6.3)，基部寬度為(1.2～)1.7～2.5(～3.5) μm，無間生瓶梗。

分生孢子綠色，亞球型或卵圓形，表面光滑，(2.3～)2.8～3.5(～4.0) μm，長寬比例為(0.8～)1.0～1.3(～1.6)。

在CMD培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d可產(chǎn)生大量的厚垣孢子，球形至亞球形，端生或間生，直徑為(5.0～)8.5～7.5(～11.0) μm。

2.4.2 菌株序列分析

菌株HB20111的ITS序列為608 bp，在GenBank上的登錄號為EU272523.1，經(jīng)http:∥www.isth.info中的TrichOKEY進行比對，分別在73、94、241、399、503處發(fā)現(xiàn)了木霉的5個DNA寡核苷酸條形編碼，種類鑒定結果表明菌株HB20111為深綠木霉(T.atroviride)。

將ITS序列提交NCBI進行比對，菌株HB20111與T.atroviride菌株ACCC32886 [MF871543.1]同源性最高，為100.0%。選取NCBI中與菌株HB20111的ITS同源性較高的序列構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結果見圖4。進化樹中HB20111與T.atroviride位于同一分枝，同源性最高，故HB20111應為T.atroviride。

圖4 基于ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS sequences

3 討論

本試驗中清水對照西洋參病株率較高，第1年病株率為38.20%、第2年病株率為83.75%，第2年清水對照病株率升高可能與立枯病情加重有關。3種供試木霉制劑在西洋參立枯病的小區(qū)防治結果表明，菌株不同，效果差異顯著。其中菌株QT21979對西洋參立枯病的防治效果比化學藥劑差，菌株TW21990對西洋參立枯病的防治效果與化學藥劑無極顯著性差異(P≥0.01)，菌株HB20111效果最好；第1年拌種處理對西洋參立枯病的防治效果、單株參增重率及總參增重率分別為71.81%、33.54%和92.75%；第2年蘸根處理對西洋參立枯病的防治效果、單株參增重率及總參增重率分別為91.04%、158.06%和1369.34%。由于在第1年的基礎上繼續(xù)施用木霉，故第2年效果更顯著。主要原因是木霉處理后大大降低了西洋參的病株率，單位面積總參增重率更加明顯，且木霉可產(chǎn)生植物生長素，促進參苗生長[21]，故對單株參鮮重也有明顯的增產(chǎn)作用，其機理有待進一步研究。

2年蘸根處理后，化學包衣處理較清水對照，雖降低了病株率，但單株參鮮重較清水對照有所降低，推測原因可能是試驗過程中用化學藥劑蘸根1 min，處理時間較長(可能處理時間10～20 s較合適)，對根造成了傷害，故處理后參苗生長緩慢。

本試驗篩選得到的木霉菌株HB20111，經(jīng)形態(tài)學和分子序列鑒定，結果均為深綠木霉(T.atroviride)，該菌株生長速度快，產(chǎn)孢能力強，抑菌譜結果表明對西洋參多種真菌病害均有較高的抑制效果。另外，菌株HB20111在西洋參上效果較好，也可能與西洋參生長的土壤濕度、溫度與木霉生長條件一致，木霉可以在根際及土壤中有效定殖，抑制病菌生長及侵染植物。

試驗結果表明，HB20111能夠替代化學殺菌劑應用于西洋參生產(chǎn)，具有潛在應用價值。下一步將進行殺蟲劑替代技術和土壤綠色消毒技術研究，構建西洋參全程綠色防控和種植技術，為鄉(xiāng)村振興提供高效、綠色、環(huán)保、可持續(xù)的技術和產(chǎn)品。