劉可春，高燕，張云，何秋霞，韓利文，李寧，季秀娜，孫晨

(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)，山東省科學院生物研究所， 山東省人類疾病斑馬魚模型與藥物篩選工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250103)

聽力殘疾是指由于各種原因?qū)е碌碾p耳聽力喪失或聽覺障礙，嚴重影響著患者的生存質(zhì)量。據(jù)世界衛(wèi)生組織2014年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，全球約有3.6億人患有耳聾疾病，占全球總?cè)丝诘?%，其中，7歲以下患兒高達80萬[1]。耳聾疾病嚴重影響患者的生活、工作和人際交往等,因此，利用合適的動物模型，對耳聾疾病的發(fā)生、發(fā)展進行研究，可為該類疾病的治療及相關(guān)藥物的研發(fā)提供新的理論依據(jù)，具有非常重要的意義。

斑馬魚(Daniorerio，Zebrafish)隸屬于鯉科，是近年來興起研究的一種新型脊椎動物模式生物，成魚體長3～4 cm。近年來，包括美國國立衛(wèi)生研究院在內(nèi)的國內(nèi)外科研院所一直致力于將斑馬魚作為模式生物應用于脊椎動物發(fā)育、生理和疾病等的研究當中[2]。在聽力研究領(lǐng)域，斑馬魚憑借其獨有的生理特征，應用日益廣泛?；诖?，本文對近年來斑馬魚模型在聽覺領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀及其進展進行了綜述。

1 斑馬魚的自身優(yōu)勢

1.1 斑馬魚的一般特征

斑馬魚是一種小型熱帶魚類，身體呈紡錘形，全身布滿多條深藍色縱紋。雌魚一年四季均可排卵，每次排卵可多至200余枚。斑馬魚體外受精、體外發(fā)育，由于其胚胎透明，因此整個發(fā)育過程均清晰可見。斑馬魚受精約120 h后，各個組織與臟器即已發(fā)育完全。受精約3個月后，可達到性成熟。受精約5個月后，可達到體成熟[3]。2005年斑馬魚的全基因組已完成測序，2013年英國的Sanger研究所完成了斑馬魚的參考基因組測序。研究人員在此基礎(chǔ)上比較了斑馬魚與人類基因組的異同，并進行了系統(tǒng)的全基因組分析，深入解析了斑馬魚編碼基因的功能。研究發(fā)現(xiàn)，約71.4%的人類基因在斑馬魚中均可找到至少一個同源基因，約69%的斑馬魚基因在人類中也可找到至少一個同源基因。除此之外，在生理結(jié)構(gòu)、蛋白功能、細胞內(nèi)部的信號通路等方面，斑馬魚也表現(xiàn)出與人類極高的相似性[4]。

1.2 斑馬魚的聽覺器官

斑馬魚的聽覺器官主要由內(nèi)耳、韋伯氏器與側(cè)線系統(tǒng)組成[5-6]。成年斑馬魚的內(nèi)耳包含3個耳石器官(橢圓囊、聽壺、球囊)和3個相互垂直排列的半規(guī)管(前、后和水平半規(guī)管)。橢圓囊和3個半規(guī)管共同構(gòu)成斑馬魚的前庭系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要負責維持機體的平衡，且對重力加速度特別敏感，聽壺與球囊則主要負責聽覺的形成[7]。在斑馬魚3個耳石器官的內(nèi)部，各有一塊加厚的區(qū)域，稱為“囊斑”，相當于哺乳動物內(nèi)耳中的柯蒂氏器(Corti’sorgan)。斑馬魚的囊斑由密集的感覺毛細胞和支持細胞組成，兩種細胞相互隔離，穿插排列。內(nèi)耳中的感覺毛細胞是一種特化的上皮細胞，可以感受聲波的機械振動[8]。當外界的聲音刺激以機械振動的方式傳遞至內(nèi)耳感覺毛細胞時，感覺毛細胞頂端的纖毛會發(fā)生彎曲，繼而引發(fā)纖毛膜離子通道的開放，導致膜的去極化，神經(jīng)遞質(zhì)隨即從感覺毛細胞底部釋放。此時，外界的聲音刺激即由機械振動轉(zhuǎn)換成了可被聽覺中樞識別的電信號。

韋伯氏器是斑馬魚前方幾個椎骨發(fā)生異變形成的一組具有特定功能的骨片，負責將魚鰾與內(nèi)耳中的球囊相互連接。當外界的聲音刺激魚體時，魚鰾可以加強聲波的機械振幅。隨后，經(jīng)由魚鰾放大的聲波通過韋伯氏器可傳遞至球囊中的感覺毛細胞，從而最終產(chǎn)生聽覺[9]。通過韋伯氏器，斑馬魚可以感受到高頻率、低強度的聲音。

側(cè)線系統(tǒng)是水生脊椎動物特有的皮膚感覺器官，能感受較低頻率的震動，具有控制趨流向的定位作用，同時還能協(xié)助視覺測定遠近物體的位置。斑馬魚的側(cè)線系統(tǒng)包括兩種機械感受器，分別是位于皮膚表面的神經(jīng)丘以及位于皮膚下側(cè)線管內(nèi)的管道神經(jīng)丘[10]。神經(jīng)丘是斑馬魚側(cè)線系統(tǒng)的基本功能單位，每個神經(jīng)丘中央均包含一簇受神經(jīng)支配的感覺毛細胞，其功能主要為探測低頻振動和局部水流，調(diào)控逃避、學習和捕食等行為[11]。斑馬魚的側(cè)線處感覺毛細胞在結(jié)構(gòu)、功能、基因調(diào)控和對耳毒性藥物的反應等方面，均與人類內(nèi)耳感覺毛細胞非常相似。當斑馬魚受精約第5 d時，其側(cè)線神經(jīng)丘處的感覺毛細胞即已發(fā)育完全[12]。除此之外，由于部分神經(jīng)丘毛細胞位于斑馬魚皮膚表面，因此其非常便于活體觀察或干預，如圖1所示。截至目前為止，斑馬魚的側(cè)線神經(jīng)丘已廣泛應用于毛細胞的發(fā)育、再生和聽覺障礙等研究當中。

圖1 斑馬魚側(cè)線毛細胞Fig.1 Sensory hair cells in the zebrafish lateral line system

2 斑馬魚在聽力研究領(lǐng)域的應用

2.1 藥物耳毒性評價領(lǐng)域的應用

耳毒性藥物是指其毒副作用主要損害聽覺系統(tǒng)，中毒癥狀為耳鳴、眩暈、耳聾和平衡失調(diào)等的一類藥物。目前由于缺少簡便而有效的耳毒性評價模型，因此臨床上批準上市的藥物大多數(shù)缺乏耳毒性的評價指標。

2005年，Ton等[13]首次以斑馬魚作為實驗動物，評價了藥物的耳毒性，并初步建立了斑馬魚藥源性耳毒模型。2011年，趙壯等[14]利用斑馬魚模型，研究了3種氨基糖苷類抗生素(慶大霉素、新霉素和鏈霉素)的耳毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述3種藥物均可影響斑馬魚的耳囊結(jié)構(gòu)和感覺毛細胞數(shù)量，同時還可影響聽覺器官發(fā)育相關(guān)的4種基因(Eya1、Val、Otx2和Dlx6a)的表達。2016年，Yoo等[15]研究了納米銀離子的耳毒性作用。結(jié)果顯示，納米銀離子對斑馬魚的感覺毛細胞具有明顯的破壞作用。2018年，Yoo等[16]利用斑馬魚作為實驗動物，研究了尼古丁對感覺毛細胞的毒害效應。結(jié)果顯示，尼古丁可誘導感覺毛細胞發(fā)生凋亡，且其毒性效果與尼古丁的作用濃度呈劑量依賴性。

2.2 耳毒性保護藥物篩選領(lǐng)域的應用

氨基苷類抗生素是一種由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接而成的苷類抗生素,因具有抗菌譜廣、抗菌能力強、用藥成本低、過敏反應少等特點，在臨床上應用非常廣泛。目前,最常見的氨基糖苷類抗生素包括慶大霉素、新霉素、鏈霉素、妥布霉素和阿米卡星等。但是，這類藥物具有較強的耳毒性，能夠殺死哺乳動物內(nèi)耳中的感覺毛細胞，導致聽力的永久性損傷。截止目前為止，氨基糖苷類藥源性耳聾尚無理想的治療方法或者藥物，所以應用合適的動物模型篩選防治該類疾病的藥物顯得至關(guān)重要。

與人類內(nèi)耳中的感覺毛細胞類似，斑馬魚的感覺毛細胞對氨基糖苷類抗生素的耳毒性反應也相當敏感。因此以斑馬魚作為動物模型，篩選具有抗耳毒性的藥物正日益受到人們的重視。2009年Ou等[17]、2012年Vlasits等[18]分別利用斑馬魚模型，對美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的部分藥物進行了耳毒性保護活性篩查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，六氫芬寧、萊克多巴胺和他莫昔芬等可抑制部分氨基糖苷類抗生素的耳毒性。2014年，Song等[19]應用斑馬魚模型研究了一種新型壞死抑制劑(NecroX-5)的感覺毛細胞保護活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NecroX-5對新霉素誘導的感覺毛細胞凋亡和線粒體損失具有明顯抑制效果。Wu等[20]應用斑馬魚模型證實，維生素C、N-乙酰半胱氨酸和羅布麻素等，均可通過降低體內(nèi)ROS的含量，進而緩解新霉素對感覺毛細胞的損傷。2016年，Oh等[21]以斑馬魚作為實驗動物，研究了抗氧化類物質(zhì)——褪黑素的耳毒性保護作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，褪黑素可減少新霉素對感覺毛細胞的損傷。Hirose等[22]利用斑馬魚模型對18種候選藥物的耳毒性保護活性進行了篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素、兒茶素和單寧酸等3種化合物對新霉素誘導的感覺毛細胞損傷具有保護作用。Esterberg等[23]研究了氨基糖苷類抗生素耳毒性的作用機制,發(fā)現(xiàn)當氨基糖苷類抗生素作用于斑馬魚后，線粒體對鈣離子的攝取可發(fā)生改變，進而誘導大量ROS的產(chǎn)生，而這可能就是氨基糖苷類抗生素誘導感覺毛細胞死亡的作用機制，2019年，吳艾欣等[24]利用斑馬魚模型研究了丹參提取物對慶大霉素導致的毛細胞損傷的保護作用。結(jié)果顯示，丹參提取物對慶大霉素誘導產(chǎn)生的耳毒性具有一定的保護功效。其中，丹酚酸B的穩(wěn)定性經(jīng)過改善后，有望成為潛在的耳毒性保護藥物。

2.3 毛細胞再生領(lǐng)域的應用

哺乳動物內(nèi)耳中的感覺毛細胞是一種終末分化的細胞，因此不可再生。如何通過技術(shù)手段，實現(xiàn)感覺毛細胞的再生，一直是聽力研究領(lǐng)域的難題之一。2003年，Harris等[25]首次報道，斑馬魚的感覺毛細胞在缺損后存在再生現(xiàn)象。因此斑馬魚模型在感覺毛細胞再生領(lǐng)域具有區(qū)別于哺乳動物的獨特優(yōu)勢。通過研究斑馬魚感覺毛細胞再生的機制，有助于科研人員早日破解哺乳動物感覺毛細胞再生這一難題。

2007年，Hernandez等[26]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚再生的側(cè)線感覺毛細胞多來源于表達Sox2基因的前體細胞。Millimaki等[27]發(fā)現(xiàn)，與哺乳動物類似，斑馬魚的Atoh1基因也是維持感覺毛細胞分化和發(fā)育的必需基因，當該基因過表達時，會誘導斑馬魚生成大量感覺毛細胞。2008年，Ma等[28]證實在斑馬魚體內(nèi)，受損后再生的感覺毛細胞主要是由其側(cè)線神經(jīng)丘處中央群的支持細胞分裂而來。2010年，Millimaki等[29]發(fā)現(xiàn)，Sox2基因可維持斑馬魚感覺毛細胞的正常生存。除此之外，在感覺毛細胞再生過程中，該基因還具有調(diào)控支持細胞直接轉(zhuǎn)化為毛細胞的功能。2011年，Schuck等[30]發(fā)現(xiàn)，腹腔注射人工合成的生長激素，可促進斑馬魚內(nèi)耳中感覺毛細胞的增殖。2012年，Mackenzie等[31]證實，支持細胞在斑馬魚感覺毛細胞的再生過程中起著重要作用。2013年，周婷婷等[32]發(fā)現(xiàn)，Eya1和Six1b兩基因在斑馬魚神經(jīng)丘處感覺毛細胞再生的過程中起著重要作用。2014年，Jiang等[33]發(fā)現(xiàn)Wnt /β-catenin信號通路不參與調(diào)控斑馬魚感覺毛細胞再生過程的啟動，只在感覺毛細胞再生過程的后期起作用。他們的工作為感覺毛細胞再生相關(guān)的信號通路研究奠定了基礎(chǔ)。2016年，Lee等[34]發(fā)現(xiàn)MYC與FGF兩條信號通路對于斑馬魚感覺毛細胞的再生是必須的，其中MYC主要參與細胞增殖，F(xiàn)GF主要參與細胞分化。2019年，Tang等[35]應用斑馬魚模型研究發(fā)現(xiàn)，當斑馬魚的神經(jīng)丘毛細胞被新霉素破壞時，Wnt和FGF兩條信號通路可以緊密結(jié)合，共同調(diào)控祖細胞與再生細胞的增殖。

3 斑馬魚在聽力研究領(lǐng)域的常用技術(shù)方法

3.1 活體染色技術(shù)

活體染色是指利用某些無毒或毒性小的染料，來標記動植物的組織和細胞，但是又不影響其生命活動或產(chǎn)生任何物理、化學變化以致引起動植物死亡的一種染色技術(shù)。斑馬魚由于體外受精、體外發(fā)育，且發(fā)育早期胚胎透明，因此特別適合活體染色。除此之外，由于斑馬魚的感覺毛細胞對某些特殊熒光染料如YO-PRO1、FM1-43和FM4-64等具有選擇吸收性，因此借助這些熒光染料和成像技術(shù)，可直接對其進行實時觀察。

2008年，Chiu等[36]利用YO-PRO1對斑馬魚的側(cè)線神經(jīng)丘毛細胞進行了活體標記，并在此基礎(chǔ)上篩查了美國食品藥品監(jiān)督管理局批準上市的約1040種藥物，結(jié)果顯示其中21種藥物具有耳毒性。2009年，Tanimoto等[37]借助FM1-43對斑馬魚內(nèi)耳中的感覺毛細胞進行標記后發(fā)現(xiàn)，當聽覺傳遞通路形成以后，伴隨著內(nèi)耳的發(fā)育，斑馬魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)的聽覺輸入也隨之產(chǎn)生。Gleason等[38]利用FM4-64標記了斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘處的感覺毛細胞。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Tmie蛋白對于斑馬魚聽力的形成和平衡的維持是必須的。2013年，Thomas等[39]使用FM1-43對斑馬魚的側(cè)線神經(jīng)丘感覺毛細胞進行染色后發(fā)現(xiàn)，順鉑誘導的毛細胞死亡依賴于毛細胞上功能型機械感知通道的存在。

3.2 行為學技術(shù)

行為學技術(shù)多用于對實驗動物的高級中樞神經(jīng)功能、運動能力和精神狀態(tài)等進行評估，可全面反映動物的整體狀態(tài)。由于斑馬魚的聽覺器官位于體表，因此很容易利用行為學技術(shù)對其聽覺功能進行檢測。這些行為學檢測方法對斑馬魚聽覺系統(tǒng)的功能評估來說，既經(jīng)濟又可靠，相應的技術(shù)簡單且有效[40]。

2005年，Zeddies等[41]研究發(fā)現(xiàn)，聽覺誘發(fā)驚恐反射可作為斑馬魚前庭功能評價的有效指標。2012年，Suli等[42]報道，趨流性實驗可用于評價斑馬魚側(cè)線神經(jīng)丘內(nèi)感覺毛細胞的功能。Cervi等[43]對斑馬魚聽覺敏感的聲頻范圍進行研究后發(fā)現(xiàn)，斑馬魚的聽覺敏感與訓練中使用的聲音刺激的頻率高低密切相關(guān)。2015年，Niihori等[44]通過評估斑馬魚模型的游泳行為，對順鉑造成的感覺毛細胞損失進行研究，首次證明游泳行為的恢復可以作為毛細胞功能修復的生物學標志。2017年，Yang等[45]揭示了驚嚇反應、前庭-眼反射和流變趨向性等應用于斑馬魚行為評估中的可行性，及其在聽覺領(lǐng)域的應用潛力。2018年，Liu等[46]發(fā)現(xiàn)，噪聲刺激可顯著干擾正常斑馬魚的行為活動，但是當斑馬魚的感覺毛細胞被慶大霉素破壞后，其對噪音的敏感度會明顯降低，行為活動也會發(fā)生顯著改變。因此該研究表明，由噪聲引起的斑馬魚行為學的變化，可作為一種評估聽力的有效方法。

3.3 基因編輯技術(shù)

基因編輯技術(shù)是近年來興起的一種能夠?qū)δ繕嘶蜻M行定向“編輯”的技術(shù)。通過該技術(shù)，可實現(xiàn)對靶標基因的功能研究。截止目前為止，科研人員已在斑馬魚模型中發(fā)現(xiàn)了約50種聽覺相關(guān)基因，這些基因中的許多種同樣影響著人類和脊椎動物的內(nèi)耳[47]。因此利用基因編輯技術(shù)，對斑馬魚的聽覺相關(guān)基因進行研究，將具有重要意義。

2017年，Schwarzer等[48]利用CRISPR/Cas9技術(shù)干擾了Dlx3b和Dlx4b兩基因在斑馬魚體內(nèi)的表達，隨后發(fā)現(xiàn),上述兩基因?qū)υ缙诟杏X毛細胞的正常發(fā)育是必需的。2018年，Pei等[49]通過CRISPR/Cas9技術(shù)，構(gòu)建了多種基因突變斑馬魚，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)了可應用于分析感覺毛細胞發(fā)育和再生的高通量篩選技術(shù)。應用該技術(shù)，他們對254種突變的基因進行了篩選，并明確了其中7種基因可特異地影響斑馬魚感覺毛細胞的再生。同年，Zhang等[50]應用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了Mtu1基因表達缺陷的斑馬魚。該斑馬魚模型表現(xiàn)出聽力障礙、驚嚇反應與游泳行為異常等。除此之外，上述基因缺陷型斑馬魚內(nèi)耳中與側(cè)線處毛細胞的數(shù)量均明顯減少,該研究為耳聾疾病的發(fā)病機制提供了新的理論依據(jù)。

3.4 轉(zhuǎn)基因技術(shù)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指利用現(xiàn)代生物技術(shù)，將人們期望的目標基因，經(jīng)過人工分離、重組后，導入并整合到生物體的基因組中，從而改善生物原有的性狀或賦予其新的性狀的一種技術(shù)。應用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，科研人員可實現(xiàn)斑馬魚聽覺器官的特異熒光標記，或構(gòu)建聽覺相關(guān)基因表達缺陷的活體動物模型，為聽覺領(lǐng)域的研究提供新的實驗動物。

2014年，馮曉等[51]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了POU4f3基因缺陷的斑馬魚，并以其為實驗動物，進一步研究了耳聾基因Gfi與POU4f3的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，POU4f3可調(diào)控Gfi的表達，且兩基因的表達均與神經(jīng)組織的發(fā)育密切相關(guān)。2017年，Li等[52]通用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建Cldn7b基因突變的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，研究發(fā)現(xiàn)，該基因可調(diào)控內(nèi)耳的形成與功能。2018年，Matern等[53]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建了一種新型的熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系——Tg(myo6b:RiboTag),被血凝素標記的線粒體可特異地在該品系斑馬魚毛細胞內(nèi)表達。以上述轉(zhuǎn)基因斑馬魚為實驗動物，結(jié)合免疫共沉淀技術(shù)，可方便科研人員研究感覺毛細胞內(nèi)特異的基因表達情況。同年，Itallia等[54]應用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建了毛細胞上的跨膜蛋白突變體斑馬魚，研究發(fā)現(xiàn)，Tmie蛋白可調(diào)控Tmc1/2蛋白在毛細胞上的定位。

4 結(jié)語

斑馬魚作為一種介于細胞與哺乳動物之間的新型脊椎動物模式生物，在聽力研究領(lǐng)域擁有巨大的潛力。以其作為實驗動物，有助于科研人員對藥物或化合物的耳毒性及耳毒性保護活性進行高通量的快速篩選評價。除此之外，科研人員還可借助斑馬魚模型，對聽力相關(guān)基因的功能進行深入研究，為人類聽覺毛細胞再生這一難題的破解提供新的實驗思路與科研數(shù)據(jù)。目前，隨著斑馬魚基因組計劃的進一步完善，以及轉(zhuǎn)基因和基因編輯等分子生物學技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，斑馬魚模型在聽力研究領(lǐng)域的應用必將更為廣泛。