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        CRISPR/Cas9技術(shù)編輯淀粉合成基因PUL

        2019-10-18 03:20:58奉寶兵魏祥進焦桂愛胡時開鄔亞文謝黎虹圣忠華邵高能唐紹清
        中國稻米 2019年5期
        關(guān)鍵詞:靶位粒重突變體

        奉寶兵 魏祥進 焦桂愛 胡時開 鄔亞文 謝黎虹 圣忠華 邵高能 唐紹清

        (中國水稻研究所/農(nóng)業(yè)部水稻生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/水稻生物學(xué)國家重點實驗室,杭州310006;第一作者:tuopuyigou@163.com;*通訊作者:sqtang@126.com)

        胚乳中淀粉的生物合成是通過一系列酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變成淀粉的過程,因此ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase,ADP glucose pyrophosphorylase)、淀粉合成酶(SS,starch synthase)、淀粉分支酶(SBE,starch branching enzyme)和淀粉去分支酶(DBE,debranching enzyme)被稱為淀粉合成過程中的4類關(guān)鍵酶[1-4]。

        DBE家族分為異淀粉酶亞家族ISA1、ISA2、ISA3和PUL普魯蘭酶。DBEs在淀粉的合成與降解中都具有重要作用[5-7]。在支鏈淀粉合成過程中,可以移除不合理分子的短鏈,并且將其連接到新鏈上,保證淀粉形成穩(wěn)定的晶體結(jié)構(gòu);在種子萌發(fā)的過程中,可以特異性切割支鏈淀粉的α-1,6糖苷鍵,保證淀粉降解,促進種子發(fā)芽[8-9]。

        前人對DBEs的異淀粉酶(isoamylase)研究報道很多,但對OsPUL的研究較少。FUJITA等[10]認為,OsPUL可以部分恢復(fù)isa1癟粒突變體的表型,并報道不同突變位點與千粒重(脫殼后)既有正相關(guān)也有負相關(guān)。FUJITA等鑒定了3種不同pul等位突變體e10、i16和EM1003。對千粒重分析發(fā)現(xiàn),EM1003(啟動子上游1 266 bp處C替換了T)千粒重為22.42±0.29 g,比野生型(千粒重為 20.37±0.03 g)增加 10.06%;而e10(第 10個外顯子內(nèi)突變)和i16(第16個內(nèi)含子內(nèi)突變)千粒重分別為 20.12±0.02 g和 19.00±0.03 g,與野生型相比略有下降。LI等[11]報道OsPUL是胚乳特異性表達基因,在開花后15 d相對表達量最高,認為在OsPUL的啟動子區(qū)存在GCN4、AACA和E2F等多個順式作用元件。

        近幾年基因組編輯(Genome editing)育種迅速發(fā)展[12-13],其主要優(yōu)勢是不依賴隨機重組或雜交過程、可以精準誘變、易獲得純合突變?;蚪M編輯技術(shù)主要有三種人工核酸酶,分別是鋅指核酸酶(ZFNs)、TALE核酸酶(TALENs)以及CRISPR系統(tǒng)[14]。中科院遺傳所高彩霞課題用優(yōu)化的Cas9蛋白對水稻OsBADH2、OsPDS和OsMPK2單個基因進行定點編輯,之后科研人員定點編輯了OsBadh2、OsGn1a、OsGT3、OsTGW6等重要的產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)基因[15-16]。

        本研究用CRISPR/Cas9技術(shù)對調(diào)控稻米脫支酶基因OsPUL進行定點編輯,進一步探索OsPUL對淀粉合成和產(chǎn)量的關(guān)系,期望獲得具有重要育種價值的PUL等位變異,并為分子育種提供材料基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        本研究所用水稻材料為粳稻品種中花11(Zhonghua 11,ZH11),以及以ZH11為轉(zhuǎn)基因受體的T0代植株、T0代植株自交后代T1植株等。所有轉(zhuǎn)基因材料單本移栽到轉(zhuǎn)基因安全圃,中耕除草,水肥管理和病蟲草害防治同大田管理。

        表1 CRISPR所用引物

        1.2 PUL編輯載體構(gòu)建

        根據(jù)CRISPR/Cas9的引物設(shè)計原理[17-18],設(shè)計2個靶序列CRISPR-PUL-1和CRISPR-PUL-2(表1)。靶序列的引物退火成雙鏈后,與線性化的SK-gRNA/AarI(20~50 ng)連接,構(gòu)建成中間載體gRNA::PUL1和gRNA::PUL2。然后,用一步法將 gRNA::PUL1、gRNA::PUL2和pC1300-Cas9等3個載體同時線性化,利用同尾酶具有相同的粘性末端的特性,將三者連接成pC1300-Cas9::PUL1-PUL2。CRISPR/Cas9相關(guān)載體SK-gRNA和pC1300-Cas9等由中國水稻研究所王克劍課題組饋贈。

        1.3 轉(zhuǎn)基因陽性植株鑒定

        將構(gòu)建好的雙靶點pC1300-Cas9::PUL1-PUL2載體通過農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻品種ZH11成熟胚愈傷組織,T0代轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過煉苗后單本移栽轉(zhuǎn)基因安全圃。分蘗期取葉片并編號,提取轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA。用潮霉素引物HptF/R(產(chǎn)物750 bp)和Cas9蛋白引物Cas9-Protein F/R(產(chǎn)物500bp)進行PCR擴增。

        同時,根據(jù)靶位點序列特征設(shè)計CAPS標記,對PCR擴增產(chǎn)物用內(nèi)切酶酶切鑒定(PCR-RE),能被切開成兩條帶,說明靶位點序列沒有發(fā)生突變,反之,則發(fā)生突變。此外,以ZH11和轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA為模板,CK-PUL-F1/R1和CK-PUL-F2/R2為引物分別擴增PUL基因的2個靶位點,PCR產(chǎn)物測序結(jié)果用SnapGene 2.32軟件進行序列比對和峰圖分析,鑒定轉(zhuǎn)基因植株中PUL的基因型。

        1.4 農(nóng)藝性狀考察

        在田間選擇同一小區(qū)里長勢一致,剔除邊行的植株,測定T1部分突變體的株高、穗長、劍葉長、劍葉寬,并計算這些植株的分蘗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實率。收種后烘干種子,去除癟粒,枝梗;隨機挑選飽滿的種子稱量千粒重,并用萬深考種儀考察粒長、粒寬、長寬比等粒形性狀。

        1.5 稻米生理生化品質(zhì)

        對T0和T1兩代種子進行稻米品質(zhì)以下生理指標檢測:總淀粉含量、直鏈淀粉含量、蛋白質(zhì)含量、糊化溫度等,每個樣品測3次,取平均值進行統(tǒng)計分析。總淀粉含量測定采用分光光度計法,直鏈淀粉含量用Megazyme試劑盒(K-AMYL07/II)測定;蛋白質(zhì)含量用近紅外透射光譜技術(shù)測定,實驗步驟參照孫成效的方法[3]。糊化溫度用差示掃描儀(DSC)測定,參照 Kweon M[19]的方法。

        1.6 粒重和淀粉合成相關(guān)基因表達分析

        取開花后12 d的種子,立即放入液氮中,然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱長期保存。選5粒冷凍種子進行RNA提取,參照Prescott和Marti的方法。用賽默飛公司的Nanodrop 2000檢測總RNA的純度和濃度,RNA質(zhì)量合格后進行反轉(zhuǎn)錄。在Roche Light Cycle 480 Real-Time PCR儀上,以Ubiquitin作內(nèi)參,用SYBR qPCR Mix配置反應(yīng)體系,反應(yīng)程序為:95℃ 30 s,95℃ 5 s/60℃ 10 s/72℃ 10 s(40 個循環(huán)),68℃ 10 min,10℃ 8 min。利用儀器自帶軟件進行分析,并用2-△△CT方法計算各基因的相對表達量和制作直方圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 PUL基因編輯陽性植株鑒定

        為了驗證PUL基因是否被成功敲除,我們首先利用CAPS引物對獲得的45株T0代轉(zhuǎn)基因植株進行PCR擴增及酶切檢測。從圖1可知,Psp1406I的酶切結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因植株中靶位點2處有6株不能被限制酶切開,即發(fā)生突變,分別為 T0-3、T0-18、T0-21、T0-22、T0-32和T0-39。MunI酶切結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因植株中靶位點1處有19株不能被限制酶切開,產(chǎn)生突變,分別為 T0-1、T0-3、T0-4、T0-7、T0-8、T0-11、T0-12、T0-15、T0-18、T0-21、T0-22、T0-25、T0-27、T0-32、T0-33、T0-36、T0-40、T0-43 和 T0-45(圖 2)。綜上所述,2 個靶位點處共有20株發(fā)生了基因編輯事件。

        圖1 Psp1406I酶切靶位點2

        圖2 MunI酶切驗證靶位點1

        圖3 Sanger測序結(jié)果

        PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果可大致判斷靶位點處是否發(fā)生突變,卻不能準確判斷是純合突變還是雜合突變,以及突變類型。因此,我們對靶序列處的500 bp左右PCR產(chǎn)物進行測序鑒定突變類型。結(jié)果表明,T0代轉(zhuǎn)基因植株中靶位點1處有11株野生型、34株突變體,突變率為75.5%;靶位點2處有21株野生型、24株突變體,突變率為53.3%。我們對上述轉(zhuǎn)基因材料于成熟期單株收種,并對T0-1、T0-6、T0-11和T0-18共4個轉(zhuǎn)基因系進行遺傳分析。從圖3可知部分T1單株的突變類型主要以單堿基的插入和單堿基的缺失為主,并造成移碼突變導(dǎo)致氨基酸序列改變,從而影響蛋白質(zhì)功能。

        由考種數(shù)據(jù)可知T0-18的粒重極顯著增加(圖4 F),于是重點對T1-18的轉(zhuǎn)基因系進行遺傳分析,結(jié)果表明,敲除載體在T1-18后代中發(fā)生了分離(圖5)。此外,通過對T1-18的24個單株P(guān)UL 2個靶位點進行測序分析,發(fā)現(xiàn)目的基因的突變位點也發(fā)生了分離(表2)。并獲得了純合單株,2個靶位點都是純合突變用mu表示;2個靶位點存在1個雜合突變用H表示。因此,我們通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對水稻淀粉脫支酶家族的普魯蘭基因進行編輯,獲得了pul的純合突變體,同時還獲得剔除載體骨架的遺傳材料2個,分別為T1-18-10和T1-18-21(圖5和表2)。

        圖4 相關(guān)農(nóng)藝性狀及PUL表達量

        圖5 T1-18轉(zhuǎn)基因植株載體序列的分離

        表2 T1-18轉(zhuǎn)基因植株P(guān)UL基因型的分離

        2.2 產(chǎn)量相關(guān)性狀考察分析

        為探明PUL基因突變后對產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響,我們對T0代突變體和野生型ZH11進行產(chǎn)量性狀考察。

        以轉(zhuǎn)基因系T0-18為代表進行詳細調(diào)查,在大田中可以看出T0-18的生育期比ZH11長,前者處于灌漿中期,后者處于灌前初期,生育期相差3~5 d,但是T0-18的株高和野生型沒有差異(圖4 A),RT-PCR結(jié)果表明,與野生型相比,T0-18植株中PUL基因的相對表達水平降低了17倍(圖4 B),從RNA水平上驗證了PUL基因被成功敲除。

        圖6 稻米品質(zhì)分析結(jié)果

        表3 野生型和T0-18胚乳的糊化特性

        圖7 T0-18的相關(guān)基因表達

        RT-PCR結(jié)果表明,T0-18的PUL基因的相對表達水平,與野生型相比降低了17倍(圖4 D);從RNA水平上驗證了PUL基因被成功敲除。轉(zhuǎn)基因系T0-18的千粒重與對照(ZH11)相比增加10.3%(圖4 F)。

        粒形分析表明,T0-1、T0-6、T0-11和 T0-18株系的粒長都比ZH11增加,達到顯著差異,其中T0-18的粒長(6.39 mm)比 ZH11的粒長(5.88 mm)增加 8.6%(圖4 B、G);T0-6和T0-18株系的粒寬與ZH11相比顯著提高,而T0-1和T0-11株系的粒寬與ZH11無顯著差異。T0-1和T0-18的長寬比均比野生型ZH11顯著增加(圖4 E、F、G)。此外,轉(zhuǎn)基因系T0-18的千粒重與野生型ZH11相比增加10.3%(圖4 F)。

        2.3 稻米品質(zhì)分析

        普魯蘭酶主要功能是去除極限糊精中的α-1,6糖苷鍵,雖然普魯蘭酶的功能在玉米、水稻、小麥、擬南芥等植物中都證實有上述功能。但是,普魯蘭酶在水稻種子淀粉合成的報道還比較少。為了探討OsPUL敲除后對稻米品質(zhì)的影響,我們檢測了總淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、蛋白質(zhì)的相對含量(圖6)和糊化溫度。

        相比野生型。T0轉(zhuǎn)基因系的淀粉含量降低,蛋白質(zhì)含量極顯著增加(圖6),糊化溫度略低0.7℃~2.0℃(表3)。T0-11和T0-18比野生型的直鏈淀粉含量極顯著降低,其他達到顯著水平。相對而言,T0-1、T0-6、T0-11、T0-18比野生型的蛋白質(zhì)含量都極顯著增加。

        2.4 品質(zhì)及粒形相關(guān)基因表達

        進一步解釋敲除突變體的稻米品質(zhì)變化,及粒形、粒重與野生型的差異,我們檢測了品質(zhì)及粒形相關(guān)基因的相對表達量。結(jié)果表明,淀粉合成相關(guān)基因和粒重相關(guān)基因在T0-18種子中的相對表達量有升有降(圖7)。表達量增加的有淀粉合成酶1(SSI)、淀粉分支酶2(BE2),以及正向調(diào)控粒形和千粒重的絲氨酸羧肽酶編碼基因GS5[11,20]和正向調(diào)控粒長的Gl7[21]。而粒重負調(diào)控基因 GS3[16,22]和 GW8[23]的表達量都較低。

        3 討論與結(jié)論

        本文通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了PUL基因的不同等位變異植株,且獲得了剔除轉(zhuǎn)基因成分的純合突變株系,為進一步利用該基因進行水稻遺傳改良提供了重要材料基礎(chǔ)。

        FUJITA等[10]認為,OsPUL可以部分恢復(fù)isa1癟粒突變體的表型,該基因還影響千粒重,此外OsPUL影響淀粉的晶體結(jié)構(gòu)和淀粉含量。我們研究發(fā)現(xiàn),OsPUL不僅調(diào)控淀粉合成,還影響儲藏蛋白的含量。以ZH11作對照,選4個代表性的T0代植株,檢測其淀粉、蛋白質(zhì)和糊化溫度等稻米營養(yǎng)指標發(fā)現(xiàn),T0-18的直鏈淀粉含量降低了18.70%,其蛋白質(zhì)含量增加了22.02%,而OsPUL敲除后對稻米外觀品質(zhì)無顯著差異(圖4 G)。

        根據(jù)前人報道,在淀粉合成酶基因中,SSI有利于促進支鏈淀粉合成,而SSIIIa則促進支鏈淀粉和超長支鏈淀粉合成[8]。SSI表達量增加,SSIIIa表達量下降(圖7),可以從側(cè)面推測參與直鏈淀粉合成的酶減少,同時參與支鏈淀粉合成的酶增加,這與T0代稻米中直鏈淀粉含量降低的結(jié)果相佐證(圖6)。PUL屬于淀粉脫支酶(DBEs)家族基因,當pul功能缺失時,并沒有像同家族的isa1(亦稱sug1)突變體一樣導(dǎo)致種子干癟,而是形成稍許腹白,可能淀粉脫支酶家族的基因有功能冗余,ISA1可以彌補pul突變對支鏈淀粉合成的影響。

        PUL基因編輯材料可能促進粒長增加,具有增產(chǎn)潛力。已有研究表明,GW8是具有SBP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,可以與GL7的啟動子結(jié)合,抑制其表達[21]。根據(jù)T0-18株系中粒形相關(guān)基因表達分析發(fā)現(xiàn),GW8表達量下降,可導(dǎo)致對GL7的抑制作用減弱,從而使得GL7的表達量升高,導(dǎo)致粒長、粒重增加。T0-18純合突變體千粒重增加,可能是光合產(chǎn)物增加,也可能是粒形粒重相關(guān)基因的表達量變化,促使千粒重增加。此外,千粒重的正調(diào)控基因GS5和GL7表達量升高,而粒形和粒重的負調(diào)控基因GW8和GS3表達量降低[16,22,24],多個粒重相關(guān)基因形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),共同作用促進了純合突變體的千粒重增加(圖7)。

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