奉寶兵 魏祥進(jìn) 焦桂愛(ài) 胡時(shí)開(kāi) 鄔亞文 謝黎虹 圣忠華 邵高能 唐紹清

（中國(guó)水稻研究所/農(nóng)業(yè)部水稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310006；第一作者：tuopuyigou＠163.com；*通訊作者：sqtang＠126.com）

胚乳中淀粉的生物合成是通過(guò)一系列酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變成淀粉的過(guò)程，因此ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase，ADP glucose pyrophosphorylase）、淀粉合成酶（SS,starch synthase）、淀粉分支酶（SBE，starch branching enzyme）和淀粉去分支酶（DBE，debranching enzyme）被稱(chēng)為淀粉合成過(guò)程中的4類(lèi)關(guān)鍵酶[1-4]。

DBE家族分為異淀粉酶亞家族ISA1、ISA2、ISA3和PUL普魯蘭酶。DBEs在淀粉的合成與降解中都具有重要作用[5-7]。在支鏈淀粉合成過(guò)程中，可以移除不合理分子的短鏈，并且將其連接到新鏈上，保證淀粉形成穩(wěn)定的晶體結(jié)構(gòu)；在種子萌發(fā)的過(guò)程中，可以特異性切割支鏈淀粉的α-1,6糖苷鍵，保證淀粉降解，促進(jìn)種子發(fā)芽[8-9]。

前人對(duì)DBEs的異淀粉酶（isoamylase）研究報(bào)道很多，但對(duì)OsPUL的研究較少。FUJITA等[10]認(rèn)為，OsPUL可以部分恢復(fù)isa1癟粒突變體的表型，并報(bào)道不同突變位點(diǎn)與千粒重（脫殼后）既有正相關(guān)也有負(fù)相關(guān)。FUJITA等鑒定了3種不同pul等位突變體e10、i16和EM1003。對(duì)千粒重分析發(fā)現(xiàn)，EM1003（啟動(dòng)子上游1 266 bp處C替換了T）千粒重為22.42±0.29 g，比野生型（千粒重為 20.37±0.03 g）增加 10.06%；而e10（第 10個(gè)外顯子內(nèi)突變）和i16（第16個(gè)內(nèi)含子內(nèi)突變）千粒重分別為 20.12±0.02 g和 19.00±0.03 g，與野生型相比略有下降。LI等[11]報(bào)道OsPUL是胚乳特異性表達(dá)基因，在開(kāi)花后15 d相對(duì)表達(dá)量最高，認(rèn)為在OsPUL的啟動(dòng)子區(qū)存在GCN4、AACA和E2F等多個(gè)順式作用元件。

近幾年基因組編輯（Genome editing）育種迅速發(fā)展[12-13]，其主要優(yōu)勢(shì)是不依賴(lài)隨機(jī)重組或雜交過(guò)程、可以精準(zhǔn)誘變、易獲得純合突變?；蚪M編輯技術(shù)主要有三種人工核酸酶，分別是鋅指核酸酶（ZFNs）、TALE核酸酶（TALENs）以及CRISPR系統(tǒng)[14]。中科院遺傳所高彩霞課題用優(yōu)化的Cas9蛋白對(duì)水稻OsBADH2、OsPDS和OsMPK2單個(gè)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，之后科研人員定點(diǎn)編輯了OsBadh2、OsGn1a、OsGT3、OsTGW6等重要的產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)基因[15-16]。

本研究用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)調(diào)控稻米脫支酶基因OsPUL進(jìn)行定點(diǎn)編輯，進(jìn)一步探索OsPUL對(duì)淀粉合成和產(chǎn)量的關(guān)系，期望獲得具有重要育種價(jià)值的PUL等位變異，并為分子育種提供材料基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用水稻材料為粳稻品種中花11（Zhonghua 11，ZH11），以及以ZH11為轉(zhuǎn)基因受體的T0代植株、T0代植株自交后代T1植株等。所有轉(zhuǎn)基因材料單本移栽到轉(zhuǎn)基因安全圃，中耕除草，水肥管理和病蟲(chóng)草害防治同大田管理。

表1 CRISPR所用引物

1.2 PUL編輯載體構(gòu)建

根據(jù)CRISPR/Cas9的引物設(shè)計(jì)原理[17-18]，設(shè)計(jì)2個(gè)靶序列CRISPR-PUL-1和CRISPR-PUL-2（表1）。靶序列的引物退火成雙鏈后，與線(xiàn)性化的SK-gRNA/AarI（20～50 ng）連接，構(gòu)建成中間載體gRNA::PUL1和gRNA::PUL2。然后，用一步法將 gRNA::PUL1、gRNA::PUL2和pC1300-Cas9等3個(gè)載體同時(shí)線(xiàn)性化，利用同尾酶具有相同的粘性末端的特性，將三者連接成pC1300-Cas9::PUL1-PUL2。CRISPR/Cas9相關(guān)載體SK-gRNA和pC1300-Cas9等由中國(guó)水稻研究所王克劍課題組饋贈(zèng)。

1.3 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株鑒定

將構(gòu)建好的雙靶點(diǎn)pC1300-Cas9::PUL1-PUL2載體通過(guò)農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻品種ZH11成熟胚愈傷組織，T0代轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過(guò)煉苗后單本移栽轉(zhuǎn)基因安全圃。分蘗期取葉片并編號(hào)，提取轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA。用潮霉素引物HptF/R（產(chǎn)物750 bp）和Cas9蛋白引物Cas9-Protein F/R（產(chǎn)物500bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

同時(shí)，根據(jù)靶位點(diǎn)序列特征設(shè)計(jì)CAPS標(biāo)記，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶酶切鑒定（PCR-RE），能被切開(kāi)成兩條帶，說(shuō)明靶位點(diǎn)序列沒(méi)有發(fā)生突變，反之，則發(fā)生突變。此外，以ZH11和轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA為模板，CK-PUL-F1/R1和CK-PUL-F2/R2為引物分別擴(kuò)增PUL基因的2個(gè)靶位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果用SnapGene 2.32軟件進(jìn)行序列比對(duì)和峰圖分析，鑒定轉(zhuǎn)基因植株中PUL的基因型。

1.4 農(nóng)藝性狀考察

在田間選擇同一小區(qū)里長(zhǎng)勢(shì)一致，剔除邊行的植株，測(cè)定T1部分突變體的株高、穗長(zhǎng)、劍葉長(zhǎng)、劍葉寬，并計(jì)算這些植株的分蘗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率。收種后烘干種子，去除癟粒，枝梗；隨機(jī)挑選飽滿(mǎn)的種子稱(chēng)量千粒重，并用萬(wàn)深考種儀考察粒長(zhǎng)、粒寬、長(zhǎng)寬比等粒形性狀。

1.5 稻米生理生化品質(zhì)

對(duì)T0和T1兩代種子進(jìn)行稻米品質(zhì)以下生理指標(biāo)檢測(cè)：總淀粉含量、直鏈淀粉含量、蛋白質(zhì)含量、糊化溫度等，每個(gè)樣品測(cè)3次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?？偟矸酆繙y(cè)定采用分光光度計(jì)法，直鏈淀粉含量用Megazyme試劑盒（K-AMYL07/II）測(cè)定；蛋白質(zhì)含量用近紅外透射光譜技術(shù)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)步驟參照孫成效的方法[3]。糊化溫度用差示掃描儀（DSC）測(cè)定，參照 Kweon M[19]的方法。

1.6 粒重和淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)分析

取開(kāi)花后12 d的種子，立即放入液氮中，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱長(zhǎng)期保存。選5粒冷凍種子進(jìn)行RNA提取，參照Prescott和Marti的方法。用賽默飛公司的Nanodrop 2000檢測(cè)總RNA的純度和濃度，RNA質(zhì)量合格后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在Roche Light Cycle 480 Real-Time PCR儀上，以Ubiquitin作內(nèi)參，用SYBR qPCR Mix配置反應(yīng)體系，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s，95℃ 5 s/60℃ 10 s/72℃ 10 s（40 個(gè)循環(huán)），68℃ 10 min，10℃ 8 min。利用儀器自帶軟件進(jìn)行分析，并用2-△△CT方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量和制作直方圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PUL基因編輯陽(yáng)性植株鑒定

為了驗(yàn)證PUL基因是否被成功敲除，我們首先利用CAPS引物對(duì)獲得的45株T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增及酶切檢測(cè)。從圖1可知，Psp1406I的酶切結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中靶位點(diǎn)2處有6株不能被限制酶切開(kāi)，即發(fā)生突變，分別為 T0-3、T0-18、T0-21、T0-22、T0-32和T0-39。MunI酶切結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中靶位點(diǎn)1處有19株不能被限制酶切開(kāi)，產(chǎn)生突變，分別為 T0-1、T0-3、T0-4、T0-7、T0-8、T0-11、T0-12、T0-15、T0-18、T0-21、T0-22、T0-25、T0-27、T0-32、T0-33、T0-36、T0-40、T0-43 和 T0-45（圖 2）。綜上所述，2 個(gè)靶位點(diǎn)處共有20株發(fā)生了基因編輯事件。

圖1 Psp1406I酶切靶位點(diǎn)2

圖2 MunI酶切驗(yàn)證靶位點(diǎn)1

圖3 Sanger測(cè)序結(jié)果

PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果可大致判斷靶位點(diǎn)處是否發(fā)生突變，卻不能準(zhǔn)確判斷是純合突變還是雜合突變，以及突變類(lèi)型。因此，我們對(duì)靶序列處的500 bp左右PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定突變類(lèi)型。結(jié)果表明，T0代轉(zhuǎn)基因植株中靶位點(diǎn)1處有11株野生型、34株突變體，突變率為75.5%；靶位點(diǎn)2處有21株野生型、24株突變體，突變率為53.3%。我們對(duì)上述轉(zhuǎn)基因材料于成熟期單株收種，并對(duì)T0-1、T0-6、T0-11和T0-18共4個(gè)轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行遺傳分析。從圖3可知部分T1單株的突變類(lèi)型主要以單堿基的插入和單堿基的缺失為主，并造成移碼突變導(dǎo)致氨基酸序列改變，從而影響蛋白質(zhì)功能。

由考種數(shù)據(jù)可知T0-18的粒重極顯著增加（圖4 F），于是重點(diǎn)對(duì)T1-18的轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明，敲除載體在T1-18后代中發(fā)生了分離（圖5）。此外，通過(guò)對(duì)T1-18的24個(gè)單株P(guān)UL 2個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)目的基因的突變位點(diǎn)也發(fā)生了分離（表2）。并獲得了純合單株，2個(gè)靶位點(diǎn)都是純合突變用mu表示；2個(gè)靶位點(diǎn)存在1個(gè)雜合突變用H表示。因此，我們通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)水稻淀粉脫支酶家族的普魯蘭基因進(jìn)行編輯，獲得了pul的純合突變體，同時(shí)還獲得剔除載體骨架的遺傳材料2個(gè)，分別為T(mén)1-18-10和T1-18-21（圖5和表2）。

圖4 相關(guān)農(nóng)藝性狀及PUL表達(dá)量

圖5 T1-18轉(zhuǎn)基因植株載體序列的分離

表2 T1-18轉(zhuǎn)基因植株P(guān)UL基因型的分離

2.2 產(chǎn)量相關(guān)性狀考察分析

為探明PUL基因突變后對(duì)產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響，我們對(duì)T0代突變體和野生型ZH11進(jìn)行產(chǎn)量性狀考察。

以轉(zhuǎn)基因系T0-18為代表進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查，在大田中可以看出T0-18的生育期比ZH11長(zhǎng)，前者處于灌漿中期，后者處于灌前初期，生育期相差3～5 d，但是T0-18的株高和野生型沒(méi)有差異（圖4 A），RT-PCR結(jié)果表明，與野生型相比，T0-18植株中PUL基因的相對(duì)表達(dá)水平降低了17倍（圖4 B），從RNA水平上驗(yàn)證了PUL基因被成功敲除。

圖6 稻米品質(zhì)分析結(jié)果

表3 野生型和T0-18胚乳的糊化特性

圖7 T0-18的相關(guān)基因表達(dá)

RT-PCR結(jié)果表明，T0-18的PUL基因的相對(duì)表達(dá)水平，與野生型相比降低了17倍（圖4 D）；從RNA水平上驗(yàn)證了PUL基因被成功敲除。轉(zhuǎn)基因系T0-18的千粒重與對(duì)照（ZH11）相比增加10.3%（圖4 F）。

粒形分析表明，T0-1、T0-6、T0-11和 T0-18株系的粒長(zhǎng)都比ZH11增加，達(dá)到顯著差異，其中T0-18的粒長(zhǎng)（6.39 mm）比 ZH11的粒長(zhǎng)（5.88 mm）增加 8.6%（圖4 B、G）；T0-6和T0-18株系的粒寬與ZH11相比顯著提高，而T0-1和T0-11株系的粒寬與ZH11無(wú)顯著差異。T0-1和T0-18的長(zhǎng)寬比均比野生型ZH11顯著增加（圖4 E、F、G）。此外，轉(zhuǎn)基因系T0-18的千粒重與野生型ZH11相比增加10.3%（圖4 F）。

2.3 稻米品質(zhì)分析

普魯蘭酶主要功能是去除極限糊精中的α-1,6糖苷鍵，雖然普魯蘭酶的功能在玉米、水稻、小麥、擬南芥等植物中都證實(shí)有上述功能。但是，普魯蘭酶在水稻種子淀粉合成的報(bào)道還比較少。為了探討OsPUL敲除后對(duì)稻米品質(zhì)的影響，我們檢測(cè)了總淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、蛋白質(zhì)的相對(duì)含量（圖6）和糊化溫度。

相比野生型。T0轉(zhuǎn)基因系的淀粉含量降低，蛋白質(zhì)含量極顯著增加（圖6），糊化溫度略低0.7℃～2.0℃（表3）。T0-11和T0-18比野生型的直鏈淀粉含量極顯著降低，其他達(dá)到顯著水平。相對(duì)而言，T0-1、T0-6、T0-11、T0-18比野生型的蛋白質(zhì)含量都極顯著增加。

2.4 品質(zhì)及粒形相關(guān)基因表達(dá)

進(jìn)一步解釋敲除突變體的稻米品質(zhì)變化，及粒形、粒重與野生型的差異，我們檢測(cè)了品質(zhì)及粒形相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，淀粉合成相關(guān)基因和粒重相關(guān)基因在T0-18種子中的相對(duì)表達(dá)量有升有降（圖7）。表達(dá)量增加的有淀粉合成酶1（SSI）、淀粉分支酶2（BE2），以及正向調(diào)控粒形和千粒重的絲氨酸羧肽酶編碼基因GS5[11，20]和正向調(diào)控粒長(zhǎng)的Gl7[21]。而粒重負(fù)調(diào)控基因 GS3[16，22]和 GW8[23]的表達(dá)量都較低。

3 討論與結(jié)論

本文通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得了PUL基因的不同等位變異植株，且獲得了剔除轉(zhuǎn)基因成分的純合突變株系，為進(jìn)一步利用該基因進(jìn)行水稻遺傳改良提供了重要材料基礎(chǔ)。

FUJITA等[10]認(rèn)為，OsPUL可以部分恢復(fù)isa1癟粒突變體的表型，該基因還影響千粒重，此外OsPUL影響淀粉的晶體結(jié)構(gòu)和淀粉含量。我們研究發(fā)現(xiàn)，OsPUL不僅調(diào)控淀粉合成，還影響儲(chǔ)藏蛋白的含量。以ZH11作對(duì)照，選4個(gè)代表性的T0代植株，檢測(cè)其淀粉、蛋白質(zhì)和糊化溫度等稻米營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，T0-18的直鏈淀粉含量降低了18.70%，其蛋白質(zhì)含量增加了22.02%，而OsPUL敲除后對(duì)稻米外觀(guān)品質(zhì)無(wú)顯著差異（圖4 G）。

根據(jù)前人報(bào)道，在淀粉合成酶基因中，SSI有利于促進(jìn)支鏈淀粉合成，而SSIIIa則促進(jìn)支鏈淀粉和超長(zhǎng)支鏈淀粉合成[8]。SSI表達(dá)量增加，SSIIIa表達(dá)量下降（圖7），可以從側(cè)面推測(cè)參與直鏈淀粉合成的酶減少，同時(shí)參與支鏈淀粉合成的酶增加，這與T0代稻米中直鏈淀粉含量降低的結(jié)果相佐證（圖6）。PUL屬于淀粉脫支酶（DBEs）家族基因，當(dāng)pul功能缺失時(shí)，并沒(méi)有像同家族的isa1（亦稱(chēng)sug1）突變體一樣導(dǎo)致種子干癟，而是形成稍許腹白，可能淀粉脫支酶家族的基因有功能冗余，ISA1可以彌補(bǔ)pul突變對(duì)支鏈淀粉合成的影響。

PUL基因編輯材料可能促進(jìn)粒長(zhǎng)增加，具有增產(chǎn)潛力。已有研究表明，GW8是具有SBP結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，可以與GL7的啟動(dòng)子結(jié)合，抑制其表達(dá)[21]。根據(jù)T0-18株系中粒形相關(guān)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，GW8表達(dá)量下降，可導(dǎo)致對(duì)GL7的抑制作用減弱，從而使得GL7的表達(dá)量升高，導(dǎo)致粒長(zhǎng)、粒重增加。T0-18純合突變體千粒重增加，可能是光合產(chǎn)物增加，也可能是粒形粒重相關(guān)基因的表達(dá)量變化，促使千粒重增加。此外，千粒重的正調(diào)控基因GS5和GL7表達(dá)量升高，而粒形和粒重的負(fù)調(diào)控基因GW8和GS3表達(dá)量降低[16，22，24]，多個(gè)粒重相關(guān)基因形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同作用促進(jìn)了純合突變體的千粒重增加（圖7）。