胡久略，商 健，王 軍，侯紫君，張瓅方，卞 華，陳麗平，王三沆，樊 赟，郅 琳

(1.河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室，河南 南陽 473004； 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)2018級碩士研究生，河南 鄭州 450046 )

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是由于腦血管的病理變化導(dǎo)致的缺血性、缺氧缺血性或者出血性腦損傷引起的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征。VD是繼阿爾茨海默癥之后世界上第二常見的老年癡呆癥，占所有癡呆癥的15%～20%[1]。認(rèn)知功能障礙被廣泛認(rèn)為是癡呆患者表現(xiàn)的典型特征[2]，包括認(rèn)知功能和運動功能缺失、功能和記憶障礙。目前，直接用于VD治療的臨床藥物較少，相關(guān)的藥效學(xué)研究不系統(tǒng)。溫腎醒腦方由經(jīng)典名方四逆湯和地黃飲子化裁而來，臨床上于治療VD，療效顯著[3]。本實驗觀察了溫腎醒腦方對VD大鼠認(rèn)知能力及Smad1、Smad4表達的影響，以期了解其對VD大鼠認(rèn)知的改善作用及其部分作用機制。

1 材料與方法

1.1 動 物

清潔級 Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量 270～300 g，購自鄭州大學(xué)動物實驗中心，證書編號為醫(yī)動字第20-012號。室溫18～22 ℃下,自由飲水,普通飼料喂養(yǎng),適應(yīng)性飼養(yǎng)1周進行實驗。

1.2 藥品、試劑與儀器

溫腎醒腦方處方組成：桂枝 12 g,附子 20 g,半夏 10 g,巴戟天15 g,赤芍 15 g,石菖蒲 12 g,淫羊藿10 g,生曬參10 g,大黃 6 g,遠志 10 g,甘草片 6 g。中藥材經(jīng)南陽理工學(xué)院中藥教研室鑒定。將藥物浸泡在水中 3 h，總體積為藥物體積的5倍，稍微煮沸 1 h×2 次，合并濾液，濃縮為質(zhì)量分?jǐn)?shù) 3 g/mL的藥液，無菌條件下裝瓶，置于4 ℃冰箱中備用。

抗BMP4大鼠多克隆抗體，購自武漢博士德生物公司，批號20170811；水合氯醛(批號20160318)、0.01M PBS(批號20160433)、Triton-X100(批號20170901)、過氧化氫(批號20161020)、甲醇(批號20160318)、無水甘油(批號20160121)，均由長沙立新生物有限公司提供；SABC試劑盒(批號20170722)、AEC顯色試劑(批號20170231)和水溶性封閉劑(批號20160833)，均由北京中山生物科技有限公司提供；Trizol試劑盒(批號9109)、一步法MMV RT-PCR試劑盒(批號RR420A)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號RR047A)，均購自invitrogen 公司。BMP4引物：正義5′-AGAG CCAACACTGTGAGGA-3′，反義5′-TGTCCAGGCACCATT TCT-3′，擴增片段長度為245 bp。β-Actin引物：正義5′-GCCAACCGTGAAA-AGATG-3′，反義5′-CCAGGATA GAGCCACCAAT-3′，擴增片段長度為700 bp。Samd1引物：正義 5′-AGAGCCAACACTGTGAGGA-3′，反義5′-TGTCCAGGCACCATTTCT-3′。Samd4引物：正義 5′-AGAGCCAACACTGTGAGGA-3′，反義5′-TGTCCAGGCACCATTTCT-3′。以上4者均由上海生物工程公司制備。

BX51型光學(xué)顯微鏡、Cedex HiRes高清圖像分析系統(tǒng)、TFT-3A331型CCD攝像頭，均為美國奧林巴斯公司產(chǎn)品；KH-Q360冰凍切片機，英國Shamton公司產(chǎn)品；UV-6100A紫外線分光光度計，美國 UVP公司產(chǎn)品；HM-PCR儀，美國 PERKLN-ELMER公司產(chǎn)品；WD-9413B凝膠分析系統(tǒng)，柯達公司產(chǎn)品；WD-2101A水平電泳系統(tǒng)，北京六一公司產(chǎn)品；SS1000臺式高速離心機，美國Beckman公司產(chǎn)品；CF-B恒溫水浴箱、中號動脈夾、4-0魚線，均為長沙麗欣生物公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組與給藥方法

將60只大鼠隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、模型對照組和溫腎醒腦方組，每組20只大鼠。動物術(shù)后分別存活 3 d 和 7 d，每組每個時間點各10只。實驗中各組死亡動物重新造模隨機遞補。 動物分組結(jié)束即開始灌胃：溫腎醒腦方組每天給予10 g/kg藥物溶液(體表面積換算，相當(dāng)于60 kg成人量的3倍)；假手術(shù)組、模型對照組和正常對照組大鼠均給予等體積的無菌蒸餾水。

1.4 模型的建立

根據(jù)中醫(yī)學(xué)“房勞-疲勞以致腎虛”及“過食肥膩滋生痰濁”傳統(tǒng)的病因?qū)W理論，采用過度疲勞、房室不節(jié)的方法[4]制作腎(陽)虛模型，高脂飲食法[5]制作動脈粥樣硬化(痰瘀)病理模型[6]：每天上午 8：00在水深 25 cm、水溫 25 ℃、體積 5 000 mL的圓形玻璃瓶中，大鼠被迫游泳，直到無力下沉。同時，將每只雄性大鼠與6只發(fā)情雌性大鼠一起籠養(yǎng)，注意每天更換發(fā)情期的雌性大鼠以誘發(fā)房室不節(jié)。一共持續(xù)1個月。喂高脂肪飼料(其中普通飼料占81.3%、膽酸鈉占0.5%、膽固醇占3%、丙基巰氧嘧啶占0.2%，豬油占10%，白糖占5%)20 g，火腿腸14 g，連用1個月。

在成功制備腎(陽)虛痰瘀模型后，根據(jù)文獻[7-8]制備急性缺血再灌注VD大鼠模型：用100 g/L 水合氯醛350 μg/g腹膜內(nèi)注射麻醉大鼠，固定大鼠于手術(shù)臺上。常規(guī)消毒，頸部切口，雙側(cè)頸總動脈分離，穿線備用。同時，給大鼠腹腔注射硝普鈉3.5 μg/g以引起低血壓。用非侵入性動脈夾夾住雙側(cè)頸總動脈 10 min，再通10 min，如此反復(fù)進行3次，再通后縫合切口。放回籠中保溫飼養(yǎng)，次日繼續(xù)灌胃。假手術(shù)組僅分離雙側(cè)頸總動脈。手術(shù)后立即注射青霉素16 U/g體質(zhì)量，連續(xù) 3 d ，以預(yù)防感染。

1.5 模型評價指標(biāo)

行為改變表現(xiàn)為動物蘇醒后提尾時左側(cè)前肢的內(nèi)收屈曲；同側(cè)Horner征；爬行時向左劃圈；站立時左側(cè)傾倒。醒來 2 h后，根據(jù)Longa等的5級量表進行神經(jīng)學(xué)評分。0級：行為無明顯變化，計0分。1級：左前肢彎曲，左后肢伸展，計-1分。2級：有左側(cè)追尾現(xiàn)象，計-2分。3級：行走困難，搖擺不定，計-3分。4級：無自發(fā)性活動，有意識障礙，計-4分。1級、2級和3級的大鼠被鑒定為成功模型并分配給每組。

1.6 檢測指標(biāo)

1.6.1 認(rèn)知能力

在灌胃給藥結(jié)束后1 h，通過定位航行實驗、空間探索實驗檢測大鼠的認(rèn)知(學(xué)習(xí)和記憶)能力。定位航行實驗： 記錄從大鼠下水到隱藏平臺的時間(即逃避潛伏期)。將逃避潛伏期記錄為 2 min，并且實驗持續(xù) 5 d。定位航行能力結(jié)束后第2天，進行空間探索實驗，2 min內(nèi)檢測隱藏平臺象限中的游泳總距離和跨越平臺的次數(shù)。

1.6.2 Smad1 和Smad4陽性細(xì)胞數(shù)量

采用免疫組織化學(xué)法檢測。①)組織處理：用100 g/L 的水合氯醛4.0 μL/g體質(zhì)量麻醉大鼠，沿胸骨的左邊緣切開胸部。將針頭從左心室插入，插入主動脈，固定針頭，夾住腹主動脈，剪開右心耳，快速滴注預(yù)先冷卻的鹽水(10 mL/min)。無血污后改滴入40 g/L 多聚甲醛(5～10 mL/min)，先快后慢，每只灌注約250 mL，開顱取大腦，去額極及小腦，40 g/L 多聚甲醛固定1 h，依次放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)150，200，300 g/L 蔗糖沉底 24 h。OTC包埋，冷凍切片機進行冠狀切片，厚度15 μm，每隔20張取4片。 冠狀切片后，在看到海馬組織后留取5到10張切片。②步驟：切片濕化，置體積分?jǐn)?shù)3%過氧化氫-甲醇溶液中浸10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，并用0.01 M PBS沖洗 2 min×3次；逐滴加入100 μL正常馬血清以封閉非特異性抗體，10 min，倒去溶液；加入抗 BMP4大鼠抗體(1∶150)，37 ℃ 溫育 1 h，0.01 M PBS洗2 min×3次；加入通用型生物素化二抗 10 μL，在溫度為 37 ℃環(huán)境中 30 min，0.01 M PBS 洗 2 min×3次；加入過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素100 μL，在溫度 37 ℃環(huán)境中10 min，0.01M PBS 洗2 min×3次；滴加AEC顯色劑10 min，0.01M PBS 洗 2 min×3次；水溶性封片劑封片。③陽性細(xì)胞計數(shù)：細(xì)胞顯示紅色為陽性細(xì)胞。單標(biāo)每個腦片在10×10視野下隨機取4個視野，用圖像處理系統(tǒng)自動計數(shù)免疫陽性細(xì)胞數(shù)，并計算其平均值。

1.6.3 Smad1 mRNA 和Smad4 mRNA

采用RT-PCR檢測。①組織處理：用100 g/L 水合氯醛4.0 μL/g體質(zhì)量麻醉大鼠，迅速取出腦并置于冰盒上。 去除腦膜、小腦，冷 PBS沖洗血污，放在-196 ℃液氮凍存?zhèn)溆谩＂诓襟E：取腦組織，進行RNA提取、沉淀、洗滌、質(zhì)量檢測；合成cDNA的第一鏈，PCR擴增，擴增產(chǎn)物電泳，電泳后在紫外光下觀察結(jié)果，并進行拍照和分析；圖像處理，凝膠圖像處理系統(tǒng)用于進行灰度值掃描，以內(nèi)參照β-actin為對照，獲得的值是基因的相對量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠認(rèn)知能力對比

定位航行實驗：第1天和第2天，各組大鼠的潛伏期對比差別無統(tǒng)計學(xué)意義。 第3天，模型對照組的潛伏時間較正常對照組長。第4天和第5天，與模型對照組對比，溫腎醒腦組的潛伏期縮短，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P值依次為P<0.05，P<0.01)。見表1。

組 別第1天第2天第3天第4天第5天正常對照組92.4±9.2277.8±8.0872.2±7.5654.5±8.1237.1±5.3假手術(shù)組93.3±9.9478.4±9.1273.1±5.7354.7±7.2239.5±4.93模型對照組95.9±7.4585.1±9.0480.1±6.35*71.1±6.95**62.8±5.00**溫腎醒腦方組91.9±7.1482.7±8.9576.1±8.6963.8±5.31#46.3±6.17##

注：與正常對照組對比，*P<0.05，**P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05，##P<0.01。

空間搜索實驗：與正常對照組對比，模型對照組游泳總距離和跨越平臺次數(shù)減少，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型對照組對比，溫腎醒腦方組游泳總距離增加(P<0.05)，跨越平臺次數(shù)增加(P<0.01)。見表2。

2.2 各組大鼠Smad1 和Smad4陽性細(xì)胞數(shù)量對比

與模型對照組對比，溫腎醒腦方組 Smad1陽性細(xì)胞減少，Smad4陽性細(xì)胞增加，7 d時的Smad1陽性細(xì)胞有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與假手術(shù)組對比，溫腎醒腦方組7 d時的Smad1和Smad4陽性細(xì)胞數(shù)、3 d時的Smad4陽性細(xì)胞數(shù)增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3、圖1、圖2。

組 別游泳總距離/cm跨越平臺次數(shù)/次正常對照組906.07±185.054.70±1.64假手術(shù)組885.91±150.134.83±1.75模型對照組519.30±158.26**2.20±0.92**溫腎醒腦方組712.82±153.99#4.30±1.77##

注：與正常對照組對比， **P<0.01；與模型對照組對比，#P<0.05，##P<0.01。

組 別nSmad1陽性細(xì)胞數(shù)3 d7 dSmad4陽性細(xì)胞數(shù)3 d7 d正常對照組106.2±1.26.4±1.33.3±1.13.2±0.9假手術(shù)組106.9±1.66.8±1.73.6±1.33.4±1.5模型對照組109.8±1.811.5±1.56.4±1.65.2±2.2溫腎醒腦方組108.6±2.0△9.2±1.7##△△6.9±1.4△△6.6±1.3△△

注：與同一時間點模型對照組對比，##P<0.01；與同一時間點假手術(shù)組對比，△△P<0.01。

A.正常對照組；B. 假手術(shù)組；C. 模型對照組； D. 溫腎醒腦方組圖1 溫腎醒腦方對VD大鼠Smad1表達(7d)的影響( 免疫組化染色法，×200)

A.正常對照組；B. 假手術(shù)組；C. 模型對照組； D. 溫腎醒腦方組圖2 溫腎醒腦方對VD大鼠Smad 4表達(7d)的影響(免疫組化染色法，×200)

2.3 各組大鼠Smad1 mRNA 和Smad4 mRNA表達對比

與模型對照組對比，7 d 時，溫腎醒腦方組的Smad1 mRNA表達減少，Smad4 mRNA表達增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與假手術(shù)組對比，在3 d 和7 d時，溫腎醒腦方組Smad1 mRNA和Smad4 mRNA表達均增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4、圖3、圖4。

組 別nSmad1 mRNA3 d7 dSmad4 mRNA3 d7 d正常對照組50.43±0.050.45±0.020.52±0.070.54±0.09假手術(shù)組50.39±0.070.48±0.080.55±0.060.53±0.05模型對照組50.83±0.091.03±0.080.63±0.040.61±0.04溫腎醒腦方組50.76±0.07△△0.82±0.06##△△0.68±0.06△△0.78±0.06##△△

注：與同一時間點模型對照組對比，##P<0.01；與同一時間點假手術(shù)組對比，△△P<0.01。

1.標(biāo)識物；2. 正常對照組；3. 假手術(shù)組；4.模型對照組；5. 溫腎醒腦方組圖3 溫腎醒腦方對VD大鼠Smad1 mRNA(7d)的影響

1.標(biāo)識物；2. 正常對照組；3. 假手術(shù)組；4.模型對照組；5. 溫腎醒腦方組圖4 溫腎醒腦方對VD大鼠Smad4 mRNA(7d)的影響

3 討 論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)是轉(zhuǎn)化生長因子超家族的成員，是一類多功能蛋白質(zhì)，具有廣泛的生物活性。BMP參與了各種組織器官的形態(tài)發(fā)生，并在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和原始細(xì)胞定向和刻板印象中發(fā)揮了重要作用。BMP是一個由20多個蛋白質(zhì)家族成員組成的家族，活動范圍廣泛，包括BMP2和BMP4。BMP活化后，其信號須從受體傳遞至核中靶基因而執(zhí)行生物學(xué)功能，在此過程中Smads起了重要作用[9]。Smads蛋白家族是BMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的細(xì)胞質(zhì)傳遞途徑，目前已發(fā)現(xiàn)8種哺乳動物Smad[10]，按結(jié)構(gòu)和功能可以分為3類: 受體調(diào)節(jié)型、通用型和抑制型Smads。受體調(diào)節(jié)型又分兩個亞類:與BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的Smads，包括Smad1、Smad5和Smad8；與TGF-β和activin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的Smads，包括Smad2和Smad3[11]。

Smad是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，是TGF-B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要成員，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。 研究發(fā)現(xiàn)，Smad蛋白參與血管生成，而Smad蛋白在許多血管疾病的發(fā)病機制中起重要作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注后Smad2和Smad4蛋白表達明顯上調(diào)，提示Smad2和Smad4參與了腦缺血的發(fā)生和發(fā)展[13]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，正常大鼠腦組織內(nèi)均有Smad1 和Smad4 蛋白與mRNA不同程度的表達，但表達程度有所不同，Smad4表達強于Smad1。腦缺血后Smad1陽性細(xì)胞和mRNA增加，7 d的數(shù)量高于3 d，而Smad4陽性細(xì)胞與mRNA隨時間而減少。溫腎醒腦方能改善 VD大鼠的認(rèn)知行為，減少 Smad1與 mRNA陽性細(xì)胞表達，增加 Smad4與 mRNA陽性細(xì)胞表達，其機制是通過調(diào)節(jié) Smad1、4的表達而達到腦保護作用的。