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        有關(guān)PCR擴(kuò)增過程中的疑慮與剖析

        2019-10-17 01:41:26洪長根
        中學(xué)生物學(xué) 2019年7期
        關(guān)鍵詞:脫氧核苷單鏈長鏈

        洪長根

        PCR就是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡稱,是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法。雖然人教版教材僅用不到400個(gè)字和兩幅圖作了簡單介紹,但基于PCR在基因工程中的重要地位,使得涉及到的訓(xùn)練越來越多、越來越難,相關(guān)的疑問和剖析大致有以下一些。

        1 PCR原料是dATP、dTTP、dCTP、dGTP的原因

        通過《必修2.遺傳與進(jìn)化>的學(xué)習(xí),學(xué)生知道DNA復(fù)制的原料是四種脫氧核苷酸,但教材的圖1-8中卻出現(xiàn)了dATP、dTTP、dCTIP、dGTP。學(xué)生知道ATP是三磷酸腺苷,但不知道dATP、dTTP、dCTP、dGTP。其實(shí)dATP、dTTP、dCTP、dGTP指的是三磷酸脫氧核苷酸(dNTP),是合成脫氧核糖核酸的“最小單位”。DNA復(fù)制時(shí),脫氧核苷酸鏈的延伸使用的原料只能是dNTP。DNA的合成需要能量,dNTP才能提供足夠的能量,而dNMP則做不到,用這種原料所完成的反應(yīng)不可逆且極易發(fā)生。因?yàn)楫?dāng)脫氧核苷酸鏈延伸一個(gè)一磷酸脫氧核苷酸(dNMP),生成焦磷酸(Fl4P207),然后焦磷酸在焦磷酸酶的催化下迅速分解為兩個(gè)磷酸,使得反應(yīng)的總吉布斯自由能大幅降低,這是細(xì)胞內(nèi)典型的焦磷酸解驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)之一。其他如糖原的磷酸解、tRNA與氨基酸的結(jié)合反應(yīng)也都是焦磷酸解驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)。

        2 PCR-個(gè)周期的大約時(shí)間

        PCR過程雖然經(jīng)過復(fù)性(90-95℃)、退火(55-60℃)、延伸(70-75℃)3個(gè)基本反應(yīng)步驟才能完成,但實(shí)驗(yàn)完成的時(shí)間卻只有2~4 min,也就是說2--3 h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

        3 引物的概念及PCR過程使用引物的原因

        在PCR技術(shù)中,擴(kuò)增目的基因的方法其實(shí)就是必修2中的DNA復(fù)制。那么,復(fù)制為什么要引物?這引物的化學(xué)本質(zhì)是什么?復(fù)制完成后引物到哪里去了?……學(xué)生會(huì)產(chǎn)生出一串關(guān)于引物的疑問。

        在PCR過程中之所以需要引物是因?yàn)樵贒NA復(fù)制中DNA聚合酶僅僅可以把新的脫氧核苷酸加到已有的DNA鏈上,據(jù)此可知:引物其實(shí)就是引子,是一小段單鏈DNA(體內(nèi)DNA復(fù)制所用的引物是RNA,RNA引物形成后,由DNA聚合酶Ⅲ催化將第一個(gè)脫氧核苷酸按堿基互補(bǔ)原則加在RNA引物3一OH端而進(jìn)入DNA鏈的延伸階段),是作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)。

        3.1 引物的長度

        DNA復(fù)制的引物為單鏈DNA,其長度常用的是18-27個(gè)脫氧核苷酸,但不應(yīng)大于38,因?yàn)檫^長的引物會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

        3.2 引物的種類

        DNA復(fù)制是以依解開的兩條鏈都作模板的,PCR也不例外,故PCR擴(kuò)增時(shí)應(yīng)有兩種引物,即分別能與兩條模板鏈配對(duì)的兩種單鏈DNA。

        3.3 需要引物的數(shù)量

        引物雖然起的作用是開始進(jìn)行脫氧核苷酸鏈的延長,但其本質(zhì)就是復(fù)制時(shí)所要合成的新鏈中的一段,完全沒有必要在DNA合成結(jié)束后脫下來再用于下個(gè)PCR周期(體內(nèi)DNA復(fù)制因用的引物是RNA,最后是被DNA聚合酶I切除的)。這就涉及到引物的消耗問題,如果擴(kuò)增的數(shù)量大,則的消耗的引物也多,具體數(shù)據(jù)應(yīng)該等于整個(gè)PCR過程中新合成的DNA單鏈數(shù)。

        3.4 引物的結(jié)合位點(diǎn)

        由于DNA復(fù)制只能是5'—3 '進(jìn)行,而DNA的兩條單鏈又是反向平行的,這就決定了兩種引物的結(jié)合位點(diǎn)是模板鏈的3端。如果一種在左側(cè)的話,另一種應(yīng)在右側(cè)。學(xué)生產(chǎn)生疑問的原因是必修2學(xué)到DNA復(fù)制產(chǎn)生的子代DNA是與親代DNA -模一樣的,這就意味著引物都應(yīng)該結(jié)合在模板3的起始端,但訓(xùn)練中涉及到PCR引物結(jié)合位點(diǎn)都不是3的起始端,如圖1所示。

        為什么會(huì)出現(xiàn)這種差別?這是因?yàn)楂@取目的基因時(shí),不可能(不容易找到這樣的限制酶)正好在目的基因的前后切下來,使得獲取的目的基因的前后端或多或少帶有一段多余的DNA片段,為了不讓多余的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞,進(jìn)而跟著表達(dá)而影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能。即便沒有影響,也由于引物擴(kuò)增跨度一般以200-500 bp為宜,特定條件下才擴(kuò)增長至10 kb的片段。所以,引物設(shè)計(jì)的結(jié)合位點(diǎn)一般是在目的基因起始序列附近。

        4 PCR的過程中出現(xiàn)3種不同長度的DNA鏈的原因

        4.1 以原始模板為模板合成的是長鏈

        從基因文庫中最初獲取的DNA經(jīng)熱分開后的就是兩條長度最長的原始模板,以此為模板合成新單鏈時(shí)。引物是從3端開始延伸,但引物前的模板(5端的一小段)不能被復(fù)制,復(fù)制的產(chǎn)物就是長鏈。長鏈比原始模板缺了一端的序列,因此,其長度不如原始模板。

        4.2 以長鏈為模板合成的是短鏈

        當(dāng)PCR進(jìn)入第二周期后,引物與新合成的長鏈結(jié)合時(shí),也不能從開始部位結(jié)合,因?yàn)樵寄0?端在上個(gè)周期復(fù)制時(shí)都復(fù)制出來了。由此可知,以長鏈為模板復(fù)制出來的新鏈又比長鏈短了一點(diǎn),名為短鏈。

        4.3 以短鏈為模板合成的也是短鏈

        從第三個(gè)周期開始,將出現(xiàn)以短鏈為模板復(fù)制出的與短鏈等長的新鏈,這樣復(fù)制出的子代DNA就是平時(shí)所說的通過PCR克隆出來的目的基因。

        5 PCR擴(kuò)增過程中各種DNA鏈的變化規(guī)律

        在PCR擴(kuò)增過程中,理論上講DNA分子總數(shù)為2''(n為PCR循環(huán)數(shù)),各種DNA單鏈總數(shù)為2×2'',但在實(shí)際反應(yīng)中并不能達(dá)到理論值。因?yàn)?,反?yīng)初期DNA片段的增加是正常的,但隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累,被擴(kuò)增的DNA片段的數(shù)量就會(huì)降下來甚至停止,這稱作平臺(tái)期。一般情況下正常的增長大約是30個(gè)循環(huán)左右。好在訓(xùn)練也只涉及到最初幾個(gè)循環(huán)的計(jì)算,具體的變化規(guī)律如下。

        5.1 原始模板鏈的數(shù)量

        原始模板永遠(yuǎn)只有兩個(gè)。因?yàn)橐栽寄0鍨槟0鍙?fù)制出的新鏈?zhǔn)情L鏈(其長度比原始模板短一點(diǎn))。

        5.2 長鏈的數(shù)量

        既然用原始模板能復(fù)制出來的是長鏈,原始模板又永遠(yuǎn)只有兩個(gè),這樣就能保證每經(jīng)過一個(gè)反應(yīng)周期,長鏈就可以增加2個(gè)。又由于以長鏈為模板復(fù)制出的新鏈為短鏈(其長度比長鏈還短一點(diǎn)),二者合起來計(jì)算,長鏈的變化規(guī)律是:PCR循環(huán)一次增加2條。

        5.3 短鏈的數(shù)量

        短鏈的情況有點(diǎn)復(fù)雜,從模板的角度分析的結(jié)果是以長鏈為模板復(fù)制出的新鏈?zhǔn)嵌替?,?dāng)短鏈出現(xiàn)后,再以短鏈為模板復(fù)制出的新鏈也是短鏈;從時(shí)間的角度分析的結(jié)果是第一個(gè)反應(yīng)周期沒有短鏈產(chǎn)生,第二個(gè)反應(yīng)周期通過以長鏈為模板首次復(fù)制出短鏈,到第三個(gè)反應(yīng)周期時(shí),就會(huì)以兩種模板同時(shí)復(fù)制出短鏈。關(guān)于短鏈的數(shù)量變化可以認(rèn)為是按指數(shù)倍數(shù)增加的,但找不到一個(gè)簡單的數(shù)學(xué)式來表達(dá),若要求某個(gè)反應(yīng)周期后的短鏈數(shù),只能根據(jù)DNA單鏈總數(shù)、原始模板數(shù)和長鏈數(shù)來推算。好在這三個(gè)數(shù)據(jù)都是簡單而有規(guī)律的,相關(guān)推算可以參考圖2進(jìn)行。

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