葛世軍，郭薇霞，易 薇，番云華，楊必清，褚嘉祐，楊昭慶△

(1.德宏傣族景頗族自治州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南芒市 678402；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究室，云南昆明 650118)

異常血紅蛋白病是一類由于珠蛋白基因突變導(dǎo)致合成的珠蛋白肽鏈的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生異常的遺傳性血液疾病，絕大多數(shù)異常血紅蛋白病是由于珠蛋白基因單個(gè)堿基置換所引起，常常不產(chǎn)生顯著的癥狀[1]。目前異常血紅蛋白病在臨床實(shí)踐中主要通過血紅蛋白(Hb)電泳方法進(jìn)行篩查，以Hb電泳出現(xiàn)異常區(qū)帶為主要特征[2]。人類Hb變異體數(shù)據(jù)庫(kù)HbVar(http://globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html)顯示我國(guó)人群中存在的異常Hb種類超過80多種，較為常見的有Hb E、 Hb Q-Thailand、Hb New York和 Hb G-Chinese等[3-4]。早期的較大規(guī)模人群調(diào)查顯示云南的異常Hb發(fā)生率居全國(guó)之首，存在有較多種類的珠蛋白基因突變，除了單一珠蛋白基因突變以外、該地區(qū)人群中還存在珠蛋白基因復(fù)合突變的情況，產(chǎn)生復(fù)雜的血液學(xué)表型[5-6]。國(guó)內(nèi)外有較多研究表明異常Hb復(fù)合突變可因突變位點(diǎn)效應(yīng)之間的相互作用，使攜帶突變的個(gè)體呈現(xiàn)出特殊及罕見的血液學(xué)表型特征，尤其是呈現(xiàn)出復(fù)雜的Hb電泳檢驗(yàn)結(jié)果，常易造成漏診和誤診，從而影響對(duì)患者的治療、預(yù)后判斷和遺傳咨詢[7-8]。本研究對(duì)1個(gè)中國(guó)人群中罕見的Hb E復(fù)合Hb Hope家系的基因型和血液學(xué)表型特征分析，為復(fù)合突變所致異常血紅蛋白病在臨床診斷中的血液學(xué)表型特點(diǎn)和分子機(jī)制提供更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 先證者：男，29歲，傣族，已婚，未采集到配偶及其子女血樣。家系成員：父親，53歲，傣族；母親，54歲，傣族。正常對(duì)照：1例來源于未檢出常見珠蛋白生成障礙性貧血基因突變的體檢人群，女，23歲，漢族。

1.2方法

1.2.1血液學(xué)檢查 在知情同意原則下，取上述成員2.5 mL乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝靜脈血，采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀Sysmex XT-2100i(日本，Sysmex公司)檢測(cè)血紅蛋白含量(HGB)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH)等血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)。Hb定量采用CAPILLARYS全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀(法國(guó)，sebia公司)及配套試劑進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.2α、β 珠蛋白基因常見缺失和突變檢測(cè) 采用AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒(中國(guó)杭州，Axygen公司)提取全血樣本DNA。采用PCR-流式熒光雜交法的商品試劑盒(中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司)檢測(cè)α、β珠蛋白生成障礙性貧血基因常見缺失突變和點(diǎn)突變位點(diǎn)，包括3個(gè)α基因點(diǎn)突變(αCS、αQS和αWS)、3種α基因缺失型突變(--SEA、-α3.7、-α4.2)和17個(gè)β基因位點(diǎn)突變(CD41-42、IVS-2-654、CD17、-28、CD26、CD71-72、CD43、-29、Int、CD14-15、CD27-28、-32、-30、IVS-1-1、IVS-1-5、CD31、Cap)。

1.2.3α、β珠蛋白基因全長(zhǎng)測(cè)序 參考文獻(xiàn)[1]設(shè)計(jì)引物，使用9700 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)，ABI公司)擴(kuò)增α、β珠蛋白基因全長(zhǎng)。擴(kuò)增采用TaKaRa LA Taq高保真酶(大連寶生物公司)。HBA1、HbA2、HBB基因PCR擴(kuò)增體系均為30 μL:每一反應(yīng)體系含2×Mix Buffer 15 μL、上下游引物各0.3 μL、LA Taq 0.2 μL、H2O 11.2 μL、DNA模板含量約100 ng。反應(yīng)條件為94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，64 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸20 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用BigDye Terminator V3.1(美國(guó)Applied Biosystems公司)試劑盒，按說明書方法進(jìn)行Sanger DNA雙向測(cè)序并根據(jù)測(cè)序結(jié)果尋找突變位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1血常規(guī)結(jié)果 該家系成員及正常對(duì)照血常規(guī)結(jié)果見表1。家系3人的HGB高于120 g/L，均未表現(xiàn)出貧血癥狀。其中先證者紅細(xì)胞(RBC)呈明顯的小細(xì)胞低色素(MCV<80 fL、MCH<28 pg),而其母親和父親的紅細(xì)胞參數(shù)均在正常參考值范圍。

表1 家系成員及正常對(duì)照血常規(guī)及Hb電泳檢測(cè)結(jié)果

注：*表示該數(shù)值為HbA合并HbX的含量

2.2Hb電泳結(jié)果 該家系成員的毛細(xì)管Hb電泳定量結(jié)果見表1。其中，先證者Hb電泳檢測(cè)時(shí)，毛細(xì)管電泳儀未能進(jìn)行各電泳條帶的自動(dòng)定位和Hb種類的識(shí)別，見圖1A。通過正常對(duì)照樣本與先證者血液樣本等比例混合后可對(duì)各區(qū)帶進(jìn)行和定位和區(qū)分，見圖1B，結(jié)果顯示在Z10區(qū)存在異常血紅蛋白HbX，結(jié)合基因檢測(cè)和Hb毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)庫(kù)，確定該條帶為Hb Hope，據(jù)此可知先證者中3個(gè)電泳區(qū)帶和定量分別為Hb Hope、Hb E、HbA2，未檢測(cè)到HbA，見圖1A。先證者的父親電泳結(jié)果也未能自動(dòng)定位各電泳區(qū)帶、并在兩峰之間形成“倒V形”的空白區(qū)域，見圖1C。按分析要求對(duì)倒V形區(qū)域進(jìn)行手動(dòng)校正后HbA2含量由4.2%降低為2.9%見圖1D。利用正常樣本定位后顯示先證者父親Z10區(qū)存在異常血紅蛋白Hb Hope(40.5%)。先證者母親血紅蛋白電泳檢出E帶(24.9%)。

注：A為先證者；B為先證者與正常對(duì)照樣本等比例混合；C為先證者父親；D為先證者父親校正后

圖1家系成員的Hb毛細(xì)管電泳圖

2.3α、β珠蛋白基因突變檢測(cè) 常見α和β珠蛋白生成障礙性貧血突變基因檢測(cè)結(jié)果顯示該先證者及其母親為Hb E雜合子、其父親未檢測(cè)到常見珠蛋白生成障礙性貧血基因突變類型。珠蛋白基因測(cè)序結(jié)果見圖2。該家系中先證者及其父親存在Hb Hope(β珠蛋白基因136位密碼子:GGT>GAT,HGVS命名法：HBB:c.410G>A)雜合突變；該家系中3人均未檢出α基因突變。結(jié)果表明該先證者的基因型為Hb E復(fù)合Hb Hope雙重突變雜合子，其父親為Hb Hope雜合子，其母親為Hb E雜合子，先證者的兩個(gè)突變分別來自其父母。

注：箭頭表示突變位點(diǎn),先證者母親在該位點(diǎn)未檢出該突變

圖2家系成員SangerDNA測(cè)序部分結(jié)果圖

3 討 論

本研究中先證者確診為Hb E復(fù)合Hb Hope的雙重雜合子，其中Hb E病是由于β珠蛋白基因第26位谷氨酸堿基替代突變?yōu)橘嚢彼?HGVS命名法：HBB:c.79G>A)，所導(dǎo)致的輕型β珠蛋白生成障礙性貧血類型。Hb E是東南亞地區(qū)最常見的β珠蛋白基因突變類型，在云南異常Hb分布中也居于首位[9]。Hb Hope突變是由于β珠蛋白肽鏈第136位密碼子發(fā)生堿基替代突變(GGT>GAT),編碼的甘氨酸被天冬氨酸取代所導(dǎo)致[10]。這一突變?cè)谔﹪?guó)人群中較為常見，中國(guó)人群中對(duì)這一突變的報(bào)道較少[11]。Hb E/Hb Hope復(fù)合突變雜合子在泰國(guó)人群中有較多報(bào)道[12]，本研究證實(shí)了該復(fù)合突變類型在中國(guó)人群中的存在，并對(duì)該家系的血液學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行了分析，旨在進(jìn)一步明確復(fù)合突變的異常血紅蛋白病的實(shí)驗(yàn)室診斷特點(diǎn)，避免誤診和漏診。

本研究中先證者血常規(guī)結(jié)果呈明顯的小細(xì)胞低色素、HbA2含量>3.5%，這與Hb E輕型β珠蛋白生成障礙性貧血特點(diǎn)相似，提示Hb E復(fù)合Hb Hope時(shí)，血液學(xué)特征以Hb E的表現(xiàn)為主，這一研究結(jié)果與國(guó)外的報(bào)道一致[8]。而其父親Hb電泳定量時(shí)，Hb Hope(Z10帶)與HbA兩個(gè)區(qū)帶之間形成了倒“V”形的空白區(qū)域(圖1C)，國(guó)外已有多個(gè)研究報(bào)道表明，由于毛細(xì)管電泳儀自動(dòng)定量時(shí)未能將這一空白區(qū)域計(jì)算入Hb總量中，因此可導(dǎo)致HbA2呈現(xiàn)假性升高，需人工調(diào)整基線和校正，才能得到準(zhǔn)確的HbA2含量[13-14]。本研究中先證者父親校正前HbA2含量為4.2%，而校正后為2.9%，如果不進(jìn)行校正的話，則易將單純的Hb Hope雜合子誤疑似為β珠蛋白生成障礙性貧血，從而產(chǎn)生誤診。有研究報(bào)道利用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)能夠?qū)b Hope與HbA完全分離，從而得到準(zhǔn)確的HbA2含量[13]，因此，在進(jìn)行復(fù)雜異常血紅蛋白病，尤其是復(fù)合突變型個(gè)體的Hb鑒定中，采用不同的Hb電泳方法和組合將有助于異常電泳區(qū)帶的區(qū)分和鑒定。

該家系中，Hb E/Hb Hope的先證者呈現(xiàn)出與父親Hb Hope雜合子和母親Hb E雜合子不同的電泳特征，表現(xiàn)為異常血紅蛋白Hb Hope含量升高及HbA的缺乏。既往研究顯示臨床Hb電泳檢驗(yàn)中，Hb Hope雜合子通常產(chǎn)生含量為40%～50%的異常Hb[15]，本研究中先證者Hb Hope異常條帶的含量高達(dá)70.0%，顯著高于單純的Hb Hope雜合子(其父親Hb Hope的含量為40.5%)，這與國(guó)外報(bào)道的Hb E復(fù)合Hb Hope的電泳特點(diǎn)相似[11]，表明同處于β肽鏈的Hb Hope與Hb E相互作用時(shí)會(huì)顯著影響異常血紅蛋白Hb Hope的含量，提示異常Hb復(fù)合突變會(huì)導(dǎo)致不同異常Hb組分的含量改變。本研究中Hb E復(fù)合Hb Hope另一個(gè)顯著的Hb電泳特點(diǎn)是會(huì)導(dǎo)致HbA缺乏，這是由于人體中的HbA是由于正常的兩條α鏈和兩條β鏈形成的四聚體蛋白質(zhì)(α2β2)[16]，而該先證者的兩條β鏈中一條來源于父親βHope，一條來源于母親βE，兩條鏈均發(fā)生了不同形式的雜合突變，因此不能形成正常的HbA，類似的現(xiàn)象在Hb E合并其他β鏈突變的個(gè)體中也有報(bào)道，例如Hb E合并Hb Rush也可導(dǎo)致HbA區(qū)帶消失[5]。由于當(dāng)樣本中缺少HbA或HbA2時(shí)，臨床檢測(cè)中常用的CAPILLARYS毛細(xì)管電泳儀無法對(duì)各組分進(jìn)行自動(dòng)定位，難以鑒定異常電泳區(qū)帶，利用正常樣本和異常樣本的混合有助于進(jìn)行定位。而先證者父親電泳結(jié)果同樣出現(xiàn)定位區(qū)帶的消失，這是因?yàn)镠b Hope與HbA遷移時(shí)間相似，出峰時(shí)間有部分重疊，因此該儀器無法自動(dòng)識(shí)別HbA，故同樣出現(xiàn)電泳定位區(qū)帶消失的情況。

4 結(jié) 論

本研究報(bào)道了Hb E復(fù)合Hb Hope家系的血液學(xué)特征，結(jié)果顯示不同的異常Hb突變類型共存時(shí)可能存在相互作用，從而使復(fù)合突變的異常血紅蛋白病可能呈現(xiàn)出與單獨(dú)雜合突變顯著不同的血液學(xué)電泳表型。利用毛細(xì)管電泳技術(shù)篩查遺傳性血紅蛋白病時(shí)可能存在復(fù)合異常Hb難以鑒別、異常Hb組分的定量誤差需要校正等特殊情況，因此還需要結(jié)合基因分析，并進(jìn)一步揭示基因型和表型的關(guān)聯(lián)性和機(jī)制，為疾病診治、預(yù)后和遺傳咨詢提供可靠的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)，避免漏診和誤診。