駱 峻,石 亮,史恒川,丁利軍,張 星,王國平

(1.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院中心實驗室，江蘇南京 210029；2.江蘇省省級機關(guān)醫(yī)院檢驗科，江蘇南京 210002；3.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院男科，江蘇南京 210001；揚州市中醫(yī)院：4.泌尿外科；5.檢驗科，江蘇揚州225009)

人乳頭瘤病毒(HPV)與女性宮頸癌的相關(guān)性已被闡明，德國科學家豪森因此獲得2008年諾貝爾醫(yī)學/生理學獎。更多研究顯示HPV感染與90%的男性肛門癌、50%的陰莖癌、10%～72%的口腔癌等其他癌癥相關(guān)[1]。因為HPV主要通過性傳播，男性HPV感染情況及感染后果日益受到關(guān)注，研究證實在男性精液、冠狀溝、陰莖體部均可檢出HPV[2]。近年，國外學者開展了HPV感染與不孕不育相關(guān)性的研究，但尚未形成完全一致性的觀點[3]。國內(nèi)男性人群這方面研究數(shù)據(jù)相對較少，本研究依據(jù)男性不育患者精液HPV檢出情況分組，觀察HPV感染與精液指標的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年10月至2018年4月在南京鼓樓醫(yī)院男科門診和揚州市中醫(yī)院泌尿男科因不育為主訴求診的男性患者精液樣本共計436例，患者年齡最小22歲、最大45歲，平均(31.41±5.26)歲。

1.2儀器與試劑 熒光定量PCR儀(Studio 5，美國ABI)；CASA分析儀(BEION S3，上海北昂)；流式細胞儀(ACCURI C6，美國BD)；全自動生化儀(BS-350E，深圳邁瑞)；HPV試劑(湖南圣湘，26分型)；DNA提取試劑盒(湖南圣湘)；DNA碎片分析試劑(星博生物)；精漿生化試劑(南京欣迪)；抗精子抗體試劑(南京欣迪)；生殖道感染指標試劑盒(上海仁度)。全部實驗依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)精液分析手冊第5版標準，參照儀器及試劑說明書進行。

1.3方法

1.3.1樣本采集與前處理 患者均于2～7 d禁欲后手淫法采集精液樣本，精液置37 ℃恒溫水浴液化30 min后輕柔混勻(不液化樣本加1%的10 mg/mL糜蛋白酶繼續(xù)水浴30 min)；記錄及測量精液體積、外觀、液化時間、液化狀態(tài)、黏稠度、pH等指標。精液常規(guī)分析、精子形態(tài)學分析、精子DNA碎片指數(shù)檢測檢測均隨即進行；精漿生化免疫相關(guān)檢測采用3 000 r/min離心10 min分離精漿后檢測；HPV分型檢測取500 μL精液樣本-20 ℃保存，集中檢測。

1.3.2DNA的提取 取500 μL精液樣本至1.5 mL離心管，1 200 r/min，2 min；棄上清，加500 μL生理鹽水充分混勻，1 200 r/min，2 min；棄上清，加入50 μL樣本釋放劑(圣湘生物S1013)，充分混勻；100 ℃金屬浴10 min，1 200 r/min，2 min后取上清液待用。

1.3.3HPV分型檢測 采用湖南圣湘HPV-DNA 26分型試劑盒，PCR-熒光探針法，檢測包括26種亞型的HPV-DNA(HPV6、11、16、18、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、66、67、68、73)。試劑室溫平衡，混勻備用；配制PCR反應液(取7種HPV PCR反應液n×38 μL分別與7份n×2 μL酶混合液，充分混勻成PCR-混合液，瞬時離心后備用)；加樣(包括待測樣本、陰性對照、陽性對照)每樣本每管10 μL，各7管；各反應管分別加入40 μL上述已配制好的7種PCR-混合液，蓋上管蓋，上機檢測。擴增條件：50 ℃ 2 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，45個循環(huán),25 ℃ 10 s。

2 結(jié) 果

2.1精液樣本HPV感染情況 436份精液樣本經(jīng)HPV分型檢測，共檢出陽性患者28例，陽性率6.4%，其中有2例檢出兩個型別重復感染，共檢出HPV型別30個，其中高危型17個、低危型13個，型別結(jié)果見表1。

表1 陽性樣本HPV型別分布

2.2HPV感染與精液指標關(guān)系 按照HPV分型檢測結(jié)果，將436例患者分為HPV陰性組(n=408)、hr-HPV(高危型)陽性組(n=16)、lr-HPV(低危型)陽性組(n=12)。各組間精液常規(guī)、精子形態(tài)學、精漿生化、傳染病學方面20余項主要臨床常用指標的差異性進行比較，其中包括精液量、精子濃度、精子總數(shù)、前向運動(PR)、非前向運動(NP)、不動(IM)、正常形態(tài)精子率、頭部缺陷率、中段缺陷率、尾部缺陷率、頂體完整率、精漿鋅、精漿糖苷酶、精漿谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、精漿果糖、DNA碎片指數(shù)(DFI)、高染色性精子指數(shù)(HDS)為計量指標；抗精子抗體(ASAB)、抗弓形蟲抗體(ATAB)、沙眼衣原體(CT)、生殖支原體(MG)、淋球菌(NG)、解脲支原體(UU)感染率為計數(shù)指標。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組間PR、中段缺陷率指標比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 精液HPV感染情況與精液指標關(guān)系比較

續(xù)表2 精液HPV感染情況與精液指標關(guān)系比較

續(xù)表2 精液HPV感染情況與精液指標關(guān)系比較

注：-表示無數(shù)據(jù)

3 討 論

HPV是常見的性傳播疾病之一，在不同年齡、地區(qū)、種族、社會經(jīng)濟地位的男性中，均有不同程度的HPV感染，尤其是性生活活躍且無保護性措施的男性中可檢測到HPV的存在[4]。由于大多數(shù)的HPV感染為無癥狀或亞臨床癥狀感染，HPV健康攜帶者已成為主要的傳染源。針對此，本研究對南京及周邊地區(qū)436例男性不育患者進行了精液HPV的檢測。

本研究發(fā)現(xiàn)，男性精液HPV感染型別分布較廣，低危型和高危型型別分達6種和8種，常見的高危型別有52、58、16等，與鄧健康等[5]、李曉瑩等[6]及雷雨等[7]的報道一致。而且，男性精液HPV感染型別與我國女性常見型別總體相符，亦證實男女之間可能存在HPV的相互傳染。

盡管有研究顯示，精液中HPV感染對精子活力和DNA完整性沒有明顯影響，且HPV感染后精子的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及妊娠率亦無明顯改變[8]，但絕大多數(shù)研究顯示，不育男性HPV感染率往往高于生育男性，且HPV陽性組的精子活力、正常形態(tài)精子百分率明顯下降，抗精子抗體陽性率增加，且一些HPV感染者往往存在多重感染[9-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，Hr-HPV組PR指標顯著低于lr-HPV組和HPV(-)組，中段缺陷率指標顯著高于lr-HPV組和HPV(-)組，與國內(nèi)外絕大多數(shù)研究結(jié)果相符。已有研究顯示[4]，HPV DNA可進入精子頭部及精液中的脫落上皮細胞中。并有研究通過熒光原位雜交技術(shù)在精子赤道區(qū)，觀察到HPV L1衣殼蛋白與精子細胞跨膜結(jié)合蛋白聚糖(CD138)形成鉸鏈，從而吸附于精子表面[13]。HPV侵入精子，病毒DNA可能與精子DNA發(fā)生整合，HPV相關(guān)蛋白可能干擾精子的正常代謝，導致精子功能異常，使男性生育能力降低。不同研究報道的結(jié)果差異，可能與研究人群、取樣方法、取樣部位、檢測方法等有關(guān)[14]。

HPV最重要的傳播途徑是性接觸，女性和男性均會感染HPV。相對女性HPV感染與致癌因素受重視程度而言，男性HPV感染引起的疾病并未引起足夠的關(guān)注。有實驗研究證實在男性龜頭、冠狀溝、陰莖表面皮膚、陰囊部皮膚、前列腺等部位均能檢出HPV。國內(nèi)外學者對女性HPV感染者的男性伴侶進行HPV檢測，結(jié)果有33%～83%的陽性率[15-17]，這一結(jié)果是顯著高于一般人群的。但是，HUANG等[18]對男性HPV感染者的女性伴侶進行檢測時，hr-HPV的檢出率只有5.32%，似乎又與常規(guī)的觀點不符，需要進一步研究探討兩者關(guān)系一致性和不一致性的具體原因。

國外研究報道男性一般人群HPV感染率為2.00%～31.00%，男性不育人群為10.00%～35.70%，陽性率差距很大[2]，本研究436例患者中HPV總陽性率6.18%，處于較低水平。但正如女性HPV在不同地區(qū)和不同人種之間感染率差距巨大一樣[19]，男性的HPV感染率是否也與區(qū)域、人種息息相關(guān)，目前尚缺少這方面的大數(shù)據(jù)研究。此外，不同研究所用檢測方法靈敏度不一，檢測型別是否全面也會影響到檢出率。一般認為分型至少應在20種以上，包含WHO確定的14種高危型和常見低危型的檢測方法是較為全面的[20]。

近年來，較多研究指出男性精液中檢出HPV與精子質(zhì)量下降[21]、與特發(fā)性精子減少癥存在顯著相關(guān)性[22]，還可能對早期的胚胎發(fā)育和滋養(yǎng)層細胞產(chǎn)生影響[23-24]，可能導致胚胎植入成功率降低和早期流產(chǎn)率增高[25]，從而影響輔助生殖的成功率。所有這些研究，雖然尚沒最終定論，但也提示應多關(guān)注精液HPV檢測重要性。本研究也得到hr-HPV組PR低于其他組的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)還導致人們對存儲在精子庫中精子質(zhì)量的擔憂。早在2000年加拿大醫(yī)學協(xié)會雜志就刊登了BASKY[26]的觀點，他認為精子捐獻者應當接受HPV檢測，這對我國正在快速發(fā)展中的精子庫建設亦有所借鑒。

本研究及眾多文獻結(jié)果提示，男性亦是HPV感染的高危人群，特別是有生育愿望的夫婦，更應關(guān)注HPV感染對男性生育力的影響。而且，有研究顯示，男性HPV感染與性傳播疾病、不育、生殖器腫瘤、女性性伴侶的HPV感染均有一定的關(guān)系[12]，因此，應采取一定的措施，降低男性的HPV感染率，其中包皮環(huán)切、減少性伴侶數(shù)目、使用安全套可能是有效的措施。研究顯示[27]，潛伏感染HPV的男性患者其性伴宮頸感染率相對更高，說明對于潛伏感染患者其性伴宮頸HPV的檢查更有意義。亦有研究發(fā)現(xiàn)[7]，性伴侶包皮過長或包莖是女性HPV感染的獨立危險因素。因此，對HPV感染男性應檢查其包皮狀態(tài)，如果包皮過長，應盡早行包皮環(huán)切術(shù)，因為其能明顯降低男性HPV感染率，并且較早進行包皮環(huán)切術(shù)效果更顯著[28]。盡管HPV感染對生育能力的影響機制尚未完全闡明，男性精液HPV感染的臨床意義也值得進一步研究和探討[29]，但其對男性生育力的影響和對女性的危害已被絕大多數(shù)學者所接受，未來我國男性人群HPV感染的大數(shù)據(jù)研究及不孕不育病因?qū)W研究將對我國提高新生兒出生率的國策起到響應和推動的積極作用。

4 結(jié) 論

本研究對436例男性不育患者精液HPV檢出情況與精液臨床相關(guān)指標進行比較研究，發(fā)現(xiàn)精子運動活躍度PR指標和精子中段缺陷率指標與HPV感染存在相關(guān)性。在此基礎上，較全面的探討了男性HPV感染對不育的影響，認為男性也不應當忽視HPV的相關(guān)檢測，尤其是有生育需求者和不育門診就診者。因為，HPV感染可能是男性不育的危險因素之一。