徐朝波，陳正偉，梅祎軍

徐朝波，陳正偉，梅祎軍，麗水市人民醫(yī)院胃腸外科 浙江省麗水市323000

核心提要：本研究通過分析Oncomie和Kaplan-Meier Plotter等數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學方法探討TMPRSS4在胃癌(gastric cancer，GC)中的表達及其作為預后分子標志物的可信性.同時采用免疫組化對生物信息分析結果進行證實.研究結果提示TMPRSS4在GC中高表達并與GC患者預后不良有關，可作為GC預后相關分子標志物.

0 引言

胃癌(gastric cancer，GC)是較為常見的實體惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率明顯增高，且呈現(xiàn)年輕化趨勢[1].2018年美國癌癥流行報告研究顯示，2018年美國新發(fā)GC患者26240例，而當年因GC死亡患者10800例，GC已成為癌癥相關死亡的重要原因[2].我國尚缺乏全國范圍內(nèi)的腫瘤流行病學報告，但區(qū)域性的腫瘤發(fā)病率研究顯示，我國GC發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐年增加并且年輕化的趨勢[3-5].目前，GC的整體預后較差，術后復發(fā)和遠處轉移是治療失敗的重要原因.影響GC預后的因素較多，如臨床分期，病理分級及治療方案等[6，7].同時也有研究報道，一些癌基因或抑癌基因的異常表達也與GC患者的預后存在相關性[8].跨膜絲氨酸蛋白酶4(transmembrane protease serines，TMPRSS4)近年來發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達，并與腫瘤的惡性生物學行為有關[9].但TMPRSS4在GC中的表達情況及其與患者預后的關系鮮有報道.因此，我們對相關基因表達數(shù)據(jù)庫進行了挖掘，探討TMPRSS4在GC組織與正常胃組織中的差異表達及其與患者生存期的關系.

1 材料和方法

1.1 材料 選取基因表達數(shù)據(jù)庫Oncomine和Kaplan-Meier plotter作為本次數(shù)據(jù)挖掘對象.篩選上述數(shù)據(jù)庫中關于GC患者癌組織和正常胃組織中TMPRSS4基因mRNA的表達情況并對比癌組織和正常組織中是否存在差異.同時回對麗水市人民醫(yī)院手術治療的50例GC患者的臨床資料，進行回顧性分析.病例資料納入標準:(1)手術治療的GC患者； (2)病理組織切片資料完整； (3)術后病理證實為GC； (4)術前未進行新輔助放化療及生物治療； (5)患者組織標本獲取經(jīng)患者同意，并經(jīng)麗水市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會討論通過.

1.2 方法 首先我們在最大的腫瘤基因表達數(shù)據(jù)庫Oncomine中分析TMPRSS4基因在多種腫瘤中是否存在差異表達，然后分析GC患者癌組織和正常胃組織中TMPRSS4基因的差異情況.數(shù)據(jù)挖掘限定條件為:(1)腫瘤類型:胃腫瘤； (2)組織對比:腫瘤組織vs正常組織； (3)數(shù)據(jù)類型:mRNA； (4)顯著性:P＜1E-4； (5)差異表達級別:大于2倍； (6)基因排序:前10%.然后利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)平臺挖掘TMPRSS4表達的芯片數(shù)據(jù)，然后利用在線分析軟件繪制GC患者TMPRSS4高低表達生存曲線，分析TMPRS4S高低表達組患者預后是否存在差異.回顧性分析手術治療的50例GC患者的臨床資料，采用免疫組織化學法檢測50例患者癌組織中TMPRSS4蛋白的表達情況，并分析TMPRSS4表達與患者臨床特征是否存在相關性.免疫組化檢測根據(jù)試劑盒步驟進行.

統(tǒng)計學處理Oncomine數(shù)據(jù)庫中中分析TMPRSS4表達差異顯著性條件為P＜1E-4； 差異表達級別＞2倍； 基因排序為前10%.納入研究的50例GC患者數(shù)據(jù)分析采用STATA 10.0軟件完成，計量資料應用mean±SD表示，組間比較采用t檢驗； 計數(shù)采用率表示，組間采用χ2檢驗；生存分析繪制生存曲線并進行Log-rank檢驗，P＜0.05為存在統(tǒng)計學差異.

2 結果

2.1TMPRSS4基因mRNA在腫瘤與正常組織中的整體表達 Oncomine數(shù)據(jù)庫中共收錄了GC、乳腺癌等常見腫瘤組織與對應正常組織中TMPRSS4的差異表達相關數(shù)據(jù)集共185項，其中存在差異表達10項，有9項在腫瘤組織中高表達，有1項在腫瘤組織中低表達(圖1).

2.2TMPRSS4在胃腫瘤中與其他基因共表達分析及信號通路分析 通過聚類層次聚類分析顯示，TMPRSS4基因在GC中呈現(xiàn)共表達的基因有LAMB3、LAD1、ANXA4等(圖2).TMPRSS4與LAMB3、LAD1、ANXA4的共表達相關系數(shù)分別為0.57，0.51和0.43.TMPRSS4與LAMB3、LAD1、ANXA4等共表達基因在功能上可能具有相似性.我們采用STRING數(shù)據(jù)庫進行了信號通路富集，信號通路提示TMPRSS4相關蛋白主要集中于細胞增殖和腫瘤相關信號通路(圖3).

2.3TMPRSS4在胃腫瘤的中表達 Oncomine數(shù)據(jù)庫中，有2項基因表達芯片數(shù)據(jù)關于TMPRSS4基因在GC組織與正常組織中差異表達的研究[10，11](圖4).2項基因表達芯片結果均提示在GC組織中，TMPRSS4表達水平高于正常胃組織(P＜0.05)(圖5).

2.4TMPRSS4高低表達GC患者生存分析 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫中，TMPRSS4表達與GC患者相關數(shù)據(jù)進行了多因素Cox回歸分析[12]，在Cox回歸模型中，我們將患者腫瘤分期、性別、Lauren分型、治療方法及腫瘤分化程度等因素加到同一個模型中，并繪制了TMPRSS4高低表達的生存曲線，并計算HR，圖5.結果顯示，TMPRSS4高低表達組總中位生存時間分別為22.0 mo和32.6 mo，高表達組顯著低于低表達組(HR = 1.31，95%CI:1.09-1.57，P＜0.05).高低表達組中位無疾病進展生存時間分別為22.40 mo和13.87 mo，高表達組顯著低于低表達組(HR = 1.27，95%CI:1.03-1.58，P＜0.05)，圖6.根據(jù)GC患者不同分期及性別進行了生存分析的亞組Cox回歸分析(我們將患者腫瘤分期、性別、Lauren分型、治療方法及腫瘤分化程度等因素加到同一個模型中，并繪制了TMPRSS4高低表達的生存曲線，并計算HR)(表1).

圖1 TMPRSS4基因mRNA在腫瘤與正常組織中的整體表達.

2.5TMPRSS4蛋白在GC組織中的表達及臨床意義TMPRSS4蛋白主要表達于細胞膜和細胞質，程棕褐色顆粒，圖7.50例GC患者中，TMPRSS4陽性表達者18例，陽性率為36.0%.TMPRSS4陽性表達與患者臨床病理特征如性別、年齡、腫瘤分期、等無明顯相關性(P＞0.05)，然而TMPRSS4陽性表達與患者腫瘤是否侵犯血管存現(xiàn)相關性，TMPRSS4陽性患者腫瘤侵犯血管比顯著高于陰性者(P＜0.05)(表2).

3 討論

TMPRSS4是一類定位于細胞膜上具有保守絲氨酸蛋白酶結構域的蛋白.該蛋白由TMPRSS4基因編碼，cDNA全長4.1 kb.現(xiàn)有研究認為TMPRSS4在多種實體腫瘤中呈現(xiàn)高表達，如結直腸癌、乳腺癌、肺癌等[9].皇甫深強等[13]采用免疫組化方法探討TMPRSS4蛋白在直腸癌中的表達及臨床意義，結果發(fā)現(xiàn)TMPRSS4蛋白表達患者5年總生存率明顯低于陰性表達者，提示TMPRSS4蛋白可能與腸癌患者的預后不良有關.李培超等[14]采用免疫組化方法探討了TMPRSS4再非小細胞肺癌中的表達情況及其與腫瘤組織中微血管密度的關系，研究提示TMPRSS4蛋白高表達與腫瘤中血管密度增高及肺癌腫瘤浸潤深度有關.TMPRSS4在GC中的表達已有相關研究[15，16]，但大多采用免疫組化或qPCR方法檢測TMPRSS4基因mRNA或蛋白表達與患者臨床特征和預后的關系，且樣本量較小，無法進行高通量大檢測.同時，免疫組化為半定量分析，其提供的TMPRSS4基因表達水平信息有限，且各個研究間存在一定的差異.因此，在本研究中，我們通過對相關基因芯片數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘，探討TMPRSS4在GC組織與正常胃組織中的差異表達及其與患者生存期的關系.

基因表達譜芯片就有高通量、標準化及對已知基因進行全面檢測的優(yōu)點.同時對芯片數(shù)據(jù)進行標準化出來后上傳相關數(shù)據(jù)庫，可進行后續(xù)深入分析.在本研究中，我們對Oncomine和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)平臺中儲存的GCTMPRSS4基因表達數(shù)據(jù)進行了挖掘和分析，結果顯示與正常胃組織比較，GC組織中TMPRSS4基因mRNA表達水平明顯上調，其高表達與患者的預后不良相關，且高表達者腫瘤侵犯血管比例較高.TMPRSS4高表達可能是GC患者預后不良的獨立危險因素.

Oncomie數(shù)據(jù)庫中TMPRSS4基因mRNA在GC組織樣本中，大多數(shù)呈現(xiàn)高表達，說明TMPRSS4基因在GC的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮了重要作用.然而，其如何調控胃黏膜細胞惡性轉化并不清楚.共表達聚類分析顯示，TMPRSS4基因在GC組織中與LAMB3，LAD1等基因存在共表達，說明TMPRSS4、LAMB3、LAD1可能在GC轉化過程具有相似的生物學功能.因此，提示上述基因可能存相關調控信號通路.

總之，TMPRSS4在包括GC等的多種腫瘤組織中高表達，并與患者預后不良相關，可作為預測GC術后復發(fā)轉移的潛在生物學標記物.

式中：s為待估計西江流域廣東段傳統(tǒng)村落的位置，si為落在以s為圓心的西江流域廣東段傳統(tǒng)村落，h為在半徑空間范圍內(nèi)第i個傳統(tǒng)村落的位置。

文章亮點

實驗背景

胃癌(gastric cancer，GC)是消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，且全世界范圍內(nèi)高發(fā).GC患者預后與腫瘤分期、臨床病理類型、治療方法等多種因素有關.近年來研究認為，某些腫瘤相關基因的差異表達可能是GC患者預后的獨立因素.跨膜絲氨酸蛋白酶4(transmembrane protease serines，TMPRSS4)近年來發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達，并與腫瘤的惡性生物學行為有關，而其在GC中的表達及其與患者預后關系仍不十分清楚.

表1 TMPRSS4表達與患者總生存及中為生存相關性亞組分析

表2 TMPRSS4表達與入組患者基本臨床特征相關性

實驗動機

探討TMPRSS4基因在GC中的表達及其與患者預后關系.

實驗目標

采用生物信息分析方法分析TMPRSS4基因在GC的表達情況，評估其作為GC患者預后分子標志物的可行性.

實驗方法

在Oncomie數(shù)據(jù)庫中分析TMPRSS4基因在GC中的差異表達情況.采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)平臺繪制生存曲線比較TMPRSS4高低表達患者生存期是否存在差異.采用免疫組織化學法檢測50例患者癌組織中TMPRSS4蛋白的表達情況，并分析TMPRSS4表達與患者臨床特征關系.

圖2 TMPRSS4基因共表達聚類分析.

圖3 TMPRSS4及其相關蛋白信號通路分析.

實驗結果

GC組織中TMPRSS4基因表達水平高于正常胃組織(P＜0.05).TMPRSS4高表達組顯著低于低表達組(HR =1.31，95%CI:1.09-1.57，P＜0.05).高低表達組中位無疾病進展生存時間顯著低于低表達組(HR = 1.27，95%CI:1.03-1.58，P＜0.05).免疫組化顯示TMPRSS4陽性表達與患者腫瘤是否侵犯血管存現(xiàn)相關性，TMPRSS4陽性患者腫瘤侵犯血管比顯著高于陰性者(P＜0.05).

圖4 TMPRSS4在胃腫瘤的中差異表達的芯片研究數(shù)據(jù)集.

圖5 胃癌組織與正常組織中TMPRSS4差異表達芯片數(shù)據(jù)比較的箱式圖.A：數(shù)據(jù)來自Cho Gastric Statistics； B：數(shù)據(jù)來自Cui Gastric Statistics.

圖6 TMPRSS4高低表達胃癌患者生存曲線.A：總生存比較； B：無疾病進展生存比較.

圖7 TMPRSS4蛋白主要表達于細胞膜和細胞質, 程棕褐色顆粒.A：TMPRSS4蛋白高表達×400； B：TMPRSS4蛋白低表達×200.

實驗結論

GC患者癌組織中TMPRSS4基因表達水平明顯升高，其高表達與患者的預后不良相關，且高表達者腫瘤侵犯血管比例較高.

展望前景

TMPRSS4基因在GC組織中高表達并與腫瘤侵犯血管有關，其高表達者預后不良.TMPRSS4可作為GC患者預后不良的潛在分子標志物.