周翰馳，陳皓，張瑞，郭剛

（天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所，衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070）

II型糖尿病是世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題。對370個(gè)國家的270萬人進(jìn)行的多國健康調(diào)查分析表明，從1980-2008年，全世界II型糖尿病的患病率翻了一番[1-2]。這種趨勢將持續(xù)到2025年，并給每個(gè)國家的醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來沉重的財(cái)政負(fù)擔(dān)[3-4]。其病理生理學(xué)不僅涉及胰腺，還涉及到肝臟、骨骼肌、脂肪組織、胃腸道、腦和腎臟[5]。國際糖尿病聯(lián)合會的報(bào)告指出，到2040年，預(yù)計(jì)全球?qū)⒂谐^6 000萬人患有糖尿病。2007年，美國用于診斷和治療糖尿病的花費(fèi)達(dá)到1 740億美元[6]。

以往的觀點(diǎn)認(rèn)為，胰島素由胰腺分泌，胰腺中主要的分泌細(xì)胞有α細(xì)胞和β細(xì)胞兩種，前者主要分泌胰高血糖素，后者主要分泌胰島素。近年來隨著研究的進(jìn)一步深入，人們發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病的致病因素中，β細(xì)胞去分化也占有一定的比例，并且在一定情況下去分化的β細(xì)胞會分化為α細(xì)胞，進(jìn)一步的破壞血糖平衡[7]；在這一過程中，PDX1扮演著重要的角色。胰腺十二指腸同源框-1蛋白（PDX1）是存在于胰腺β細(xì)胞中的含282個(gè)氨基酸的同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子。PDX-1是β細(xì)胞中胰島發(fā)育和胰島素基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可以加強(qiáng)β細(xì)胞活性，減少β細(xì)胞凋亡，并且防止其去分化。PDX-1在發(fā)育早期的所有細(xì)胞中均有表達(dá)，成年后主要限于胰腺和十二指腸。此外，還有研究指出經(jīng)PDX-1處理的小腸上皮細(xì)胞（IEC-6）可以分化成為合成胰島素的細(xì)胞[8]。

有諸多研究表明胰腺外存在胰島素或胰島素類似物。有文章指出，通過RT-PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn)，在胎鼠和乳鼠的大腦、肝臟、視網(wǎng)膜等組織中發(fā)現(xiàn)了前胰島素原和胰島素類似物[9]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，也已經(jīng)有研究證實(shí)下丘腦有胰島素分泌[10]。在STZ小鼠肝臟、脂肪、骨髓等組織中也發(fā)現(xiàn)了胰島素mRNA[11]。

在胚胎發(fā)育階段，胰島內(nèi)分泌細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞有著共同的起源，這意味著小腸中可能有某些細(xì)胞具有分泌胰島素的潛能。小腸可以分泌包括胰高血糖素在內(nèi)的多種胰肽，但是一直以來少有證據(jù)能夠證明小腸可以合成胰島素。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，小腸含有胰腺細(xì)胞特異性的識別蛋白，該蛋白質(zhì)為胰島細(xì)胞抗原512（ICA512）。ICA512是一種受體型PTP樣蛋白，含有跨膜區(qū)，細(xì)胞內(nèi)PTP樣結(jié)構(gòu)域和一個(gè)胞外N端，定位于分泌顆粒，ICA-512僅在胰島細(xì)胞中表達(dá)并且參與調(diào)節(jié)分泌顆粒的胞吐作用。本研究選用未經(jīng)處理的C57BL/6J小鼠，針對小腸不同部位，從基因和蛋白等水平來證明有胰島素在小腸的細(xì)胞中合成。

1 材料與方法

1.1 動物材料 所有的實(shí)驗(yàn)用小鼠均購自北京華寶生物科技有限公司。小鼠在無特殊病原菌的動物房喂養(yǎng)，室溫為恒溫23℃。適應(yīng)1周后，選取健康的雄性C57BL/6J小鼠（n=5）通過腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，然后處死，剪取十二指腸、空腸、回腸、胰腺。所有動物實(shí)驗(yàn)得到動物倫理和實(shí)驗(yàn)部門的批準(zhǔn)，且按照天津醫(yī)科大學(xué)委員會的要求進(jìn)行。

1.2 免疫熒光檢測 將動物組織用石蠟包埋，制成切片，二甲苯脫蠟，100%～70%濃度梯度乙醇脫水，Tris-EDTA溶液抗原修復(fù)，室溫下Tirton處理15min，經(jīng)PBS漂洗后，用牛奶封閉，分別用胰島素抗體、PDX1抗體、ICA-512抗體4℃孵育過夜，PBS漂洗后，分別用FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗和TRITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗孵育，室溫1 h，用DAPI將細(xì)胞核染色，封片。在熒光顯微鏡下檢測。

所用試劑如下：胰島素抗體（1:1 000,ab6995,abcam,UK），PDX1抗體（1:2 000,ab47267,abcam,UK），ICA-512抗體（1:500,sc-130570,santa cruz,USA），F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗小鼠二抗 (1:200,ZF-0312,ZSGB,Beijing,China），TRITC 標(biāo)記的抗兔二抗（1:200,ZF-0316,ZSGB,Beijing,China）。

1.3 電子掃描顯微鏡檢測 剪取一小段組織放入2.5%戊二醛固定液中，經(jīng)PBS漂洗后用1%鋨酸緩沖液固定，用濃度50%～100%濃度梯度的丙酮脫水，再用spurr包埋劑進(jìn)行包埋，待包埋完成后，切片在電子掃描顯微鏡下觀察。

1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR） 用TRIzol（9108,TaKaRa,Biotech,Japan）裂解小鼠組織，加入氯仿，4℃離心，13000r/min，取上清液，加等體積異丙醇，4℃離心，沉淀加75%乙醇，漂洗離心，13000r/min，干燥后，加入20 μL DEPC水，即為組織RNA。逆轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA（AT301-03,TransGen Biotech,Beijing,China）。RT-PCR（AQ131-04,TransGenBiotech,Beijing,China）檢測內(nèi)參β-actin以及胰島素mRNA的表達(dá)量。

胰島素引物序列：上游 5′-CTGGTGGG CATCCAGTAACC-3′，下游 5′-ACACACCAGGTAGAGAGCCT-3′，產(chǎn)物長度 209bp。

β-actin引物序列：上游 5′-CATTGCTGA CAGGATGCAGAAGG-3′，下游 5′-TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG-3′，產(chǎn)物長度 138bp。

擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性1 min,然后依次為94℃變性10 s,58℃退火15 s,72℃延伸20 s,共40個(gè)循環(huán)。每次PCR反應(yīng)至少重復(fù)3次。

1.5 Western印跡分析 組織用RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF分解，按組織：RIPA：PMSF=20mg：100μL：1 μL的比例提取蛋白質(zhì)，通過聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）之后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes,NC）上，用 5%的脫脂奶粉在室溫下封閉2 h，用胰島素抗體4℃孵育過夜，PBST漂洗后，與HRP標(biāo)記的抗兔二抗結(jié)合，室溫1 h，PBST漂洗后，用ECL印跡檢測使蛋白條帶可視化，檢測其表達(dá)量。

所用試劑如下：胰島素抗體（1∶2 000，15848-1-AP,proteintech），GAPDH 抗體 （1∶5 000，AP0066，Bioworld Technology，Inc.,USA），辣根過氧化物酶抗兔二抗（1∶2 000，BS13278，Bioworld Technology，Inc.,USA），ECL 印跡檢測試劑（WBKLS0500，Millipore Corporation）。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)小腸表達(dá)胰島素 將小腸按照十二指腸、空腸、回腸分成3組，以胰腺作為陽性對照，分別檢測其胰島素及PDX1的表達(dá)。結(jié)果顯示胰島素及PDX1在部分細(xì)胞中同時(shí)存在（圖1A），十二指腸表達(dá)量略少于空腸和回腸，空腸和回腸表達(dá)量沒有顯著差異。同時(shí)筆者還發(fā)現(xiàn)在小腸中存在少量的 ICA-512（圖 1B）。

電子掃描顯微鏡觀察的結(jié)果顯示，在十二指腸（圖 2A），空腸（圖 2B），回腸（圖 2C）中都存在類似胰島素的分泌顆粒，表達(dá)量上并無明顯差異。

形態(tài)學(xué)的結(jié)果表明，小腸中的胰島素存在于細(xì)胞內(nèi)部，眾所周知，胰島素是作用在細(xì)胞表面胰島素受體的一種蛋白質(zhì)，胰島素本身在完成生理作用的過程中不會進(jìn)入細(xì)胞，所以可以認(rèn)為，筆者檢測到的胰島素是由小腸細(xì)胞自身合成的，并非由胰島β細(xì)胞合成再經(jīng)血液轉(zhuǎn)運(yùn)而來。

圖1 免疫熒光檢測小腸中的胰島素Fig 1 Immunofluorescence detection of insulin in the small intestine

圖2 電鏡檢測小腸中的胰島素分泌顆粒Fig 2 Electron microscopy of insulin secretion granules in the small intestine

2.2 RT-PCR及western檢測小腸胰島素陽性 用β-actin為內(nèi)參，RT-PCR檢測十二指腸、空腸、回腸和胰腺中胰島素mRNA的相對表達(dá)量（圖3A）?？漳c與十二指腸和回腸的胰島素相對表達(dá)量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），小腸組織與胰腺之間差異更為明顯（P＜0.01）。通過Western blot對小腸中胰島素表達(dá)量的檢測得到了和RT-PCR相一致的結(jié)果（圖3B），同樣選取β-actin作為內(nèi)參，圖中顯示的是胰島素在各個(gè)部位的相對表達(dá)量，其中空腸與十二指腸和回腸的表達(dá)量具有明顯差異（P＜0.05）。和RT-PCR結(jié)果一致，小腸中空腸的胰島素表達(dá)量最高，十二指腸和回腸表達(dá)量沒有顯著差別。取樣時(shí)小鼠空腹 8h，血糖水平為 7.3mol/L，8.5mol/L，5.8mol/L。

圖3 RT-PCR及WB分析小腸中胰島素mRNA和蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量Fig 3 RT-PCR and WB analysis of relative expressions of insulin mRNA and protein in the small intestine

3 討論

I型糖尿病致病原因是胰島β細(xì)胞功能損壞，II型糖尿病的病因除β細(xì)胞功能損害外還有胰島素抵抗等等。目前治療糖尿病的手段主要有口服降糖藥物、胰島素注射、胰島素泵等，無論哪種治療方法都需要長期用藥，不但對患者身心有所危害也對患者經(jīng)濟(jì)條件有一定挑戰(zhàn)。筆者急需找到新的治療方法來解決日趨嚴(yán)峻的糖尿病防治問題。目前，胰島細(xì)胞移植療法和干細(xì)胞培育療法獲得了一定的關(guān)注，但術(shù)后的免疫排斥反應(yīng)以及細(xì)胞來源的缺乏造成了很大阻礙。本研究證明小腸具有生物合成胰島素的功能，可能為未來糖尿病的防治提供一個(gè)新的思路。

長久以來，有許多研究和報(bào)道顯示，體內(nèi)存在非胰腺胰島素或稱胰外胰島素。在小腸中發(fā)現(xiàn)了有前胰島素原和胰島素mRNA存在[9，12]。短期禁食會促使小鼠的下丘腦表達(dá)胰島素[10]。在糖尿病小鼠的肝臟、脂肪、脾臟、骨髓及胸腺中發(fā)現(xiàn)了胰島素原的mRNA和蛋白質(zhì)[11]。筆者可以看到在糖尿病或禁食等非正常狀態(tài)下，機(jī)體很多組織都具有一定的表達(dá)胰島素的能力。而在正常的健康狀態(tài)下，僅有小腸檢測出了胰島素基因轉(zhuǎn)錄陽性。這說明在正常的身體能量代謝過程中，小腸胰島素參與了某些調(diào)控能量代謝的過程。此外，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，將8周齡Wister大鼠禁食24 h，分別灌胃50%葡萄糖溶液、牛血清白蛋白溶液、油脂懸液，結(jié)果顯示小腸部分存在動態(tài)變化的胰島素mRNA，且與胰腺表達(dá)高峰時(shí)間不同[13]。

在探索小腸是否能成為潛在的胰島素分泌的器官時(shí)，一種蛋白質(zhì)GLP-1引起了極大的注意。GLP-1是一種胰高血糖素基因編碼的由回腸L細(xì)胞分泌的腸促激素，其在體內(nèi)的主要活性形式為GLP-17-37和GLP-17-36，主要作用在胰島β細(xì)胞，具有防止β細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰島素分泌等作用[14-15]。GLP-11-37在體內(nèi)的作用尚不明確，但研究發(fā)現(xiàn)其可以誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞分泌胰島素[16]，還可以增加小鼠的葡萄糖耐受性[17]。有團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步證明，GLP-1可以誘導(dǎo)大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞（IEC-6）表達(dá)胰島素，此外，給大鼠口服可以表達(dá)GLP-11-37的工程菌制片，可以有效增加大鼠的糖耐量[18]。

小腸胰島素的作用雖然尚不明確，但我們根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)資料猜測其可能具有以下兩種功能：一是小腸胰島素的分泌受葡萄糖含量的影響，同時(shí)回腸L細(xì)胞分泌GLP-1的過程受到胰島素含量和血糖水平的調(diào)控[14-15]，小腸胰島素可以通過旁分泌或自分泌結(jié)合血糖水平來調(diào)節(jié)GLP-1的表達(dá)，進(jìn)一步影響胰島β細(xì)胞生成胰島素。二是小腸胰島素可能具有調(diào)節(jié)局部血糖的作用，尤其在進(jìn)食后及腸道吸收葡萄糖的過程中，通過小腸分泌的胰島素，防止由于集中吸收葡萄糖而使血糖快速上升造成危害。