張瑩華，馬勇杰

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院腫瘤細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，乳腺癌防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300060）

乳腺癌是女性發(fā)病率最高且異質(zhì)性很強(qiáng)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的身心健康[1]。因此探究與乳腺癌預(yù)后相關(guān)的基因?qū)?duì)其治療有很大意義。Intersectin1（ITSN1）是一種細(xì)胞銜接蛋白，主要參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等生物學(xué)過程[2]。除此之外，ITSN1還參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明，敲低ITSN1-S可促進(jìn)肺內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[3-4]。ITSN1參與神經(jīng)母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生發(fā)展[5-6]。ITSN1在唐氏綜合征、阿爾茨海默病和亨廷頓病中異常表達(dá)[7]。然而，目前關(guān)于ITSN1在乳腺癌中的研究較少，僅有兩篇文章報(bào)道ITSN1在乳腺癌中的作用，其中也不涉及ITSN1在乳腺癌各亞型中的研究。2015年的一項(xiàng)研究首次報(bào)道ITSN1和ITSN2存在于乳腺癌細(xì)胞的侵襲性突起中，并且與WIP相互作用，這可能有助于侵襲性偽足的形成，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。2017年，有研究發(fā)現(xiàn)CR16和ITSN1在乳腺癌細(xì)胞中相互作用，可以增加ITSN1與F-肌動(dòng)蛋白絲的結(jié)合，這可能在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑和細(xì)胞侵襲中發(fā)揮重要作用[9]。以上結(jié)果表明，ITSN1在乳腺癌中可能主要通過調(diào)控細(xì)胞骨架重塑和細(xì)胞侵襲/轉(zhuǎn)移影響細(xì)胞存活，對(duì)于ITSN1在其中發(fā)揮的具體功能還不是很清楚。為此，本研究利用數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)ITSN1對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的影響，期望能夠進(jìn)一步闡明ITSN1在乳腺癌中可能發(fā)揮的功能。

1 材料與方法

1.1 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù) Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kmplot.com/analysis/）包含了乳腺癌樣本基因mRNA表達(dá)水平的數(shù)據(jù)及樣本來源病例的臨床預(yù)后相關(guān)信息。運(yùn)用此數(shù)據(jù)庫(kù)，筆者分析了ITSN1 mRNA表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，所用探針I(yè)D為35776-at。對(duì)3 955例患者進(jìn)行無復(fù)發(fā)生存（recurrence free survival，RFS）分析，1 402 例患者進(jìn)行總生存（overall survival，OS）分析，這些樣本來源于該數(shù)據(jù)庫(kù)中保存的33個(gè)GSE，E-MTAB-365和E-TABM-43?？偵嫫诙x為從疾病確診日期到最后一次隨訪日期或患者死于乳腺癌的日期，無復(fù)發(fā)生存期定義為從開始用藥到乳腺癌患者最早出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或者死亡的時(shí)間。病例根據(jù)ITSN1 mRNA中位表達(dá)水平分成高表達(dá)組和低表達(dá)組，分別比較兩組乳腺癌患者預(yù)后的情況。ITSN1 mRNA的中位表達(dá)水平為635，高表達(dá)組為2 908，低表達(dá)組為108。運(yùn)用COX回歸分析方法計(jì)算兩組病例之間的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)比（hazard rations，HRs）和95%置信區(qū)間，同時(shí)計(jì)算log-rank P值，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

進(jìn)行總生存分析的乳腺癌病例（n=1 402）來自以下數(shù)據(jù)庫(kù)：E-MTAB-365（n=537），E-TABM-43（n=37），GSE11121（n=200），GSE12093 （n=136），GSE12276（n=204），GSE1456（n=159），GSE16391（n=55），GSE16446 （n=120），GSE16716 （n=47），GSE17705（n=196），GSE17907（n=54），GSE18728（n=61），GSE19615 （n=115），GSE20194 （n=45），GSE20271（n=96），GSE2034（n=286），GSE20685（n=327），GSE20711 （n=90），GSE21653 （n=240），GSE2603（n=99），GSE26971（n=276），GSE2990（n=102），GSE31448 （n=71），GSE31519 （n=67），GSE32646（n=115），GSE3494（n=251），GSE37946（n=41），GSE41998（n=279），GSE42568（n=121），GSE45255（n=139），GSE4611（n=153），GSE5327（n=58），GSE6532（n=82），GSE7390（n=198），GSE9195（n=77）。

進(jìn)行無復(fù)發(fā)生存分析的病例（n=3 955）來以下自數(shù)據(jù)庫(kù)：E-MTAB-365（n=537），E-TABM-43（n=37），GSE11121 （n=200），GSE12093 （n=136），GSE12276（n=204），GSE1456（n=159），GSE16391（n=55），GSE16446 （n=120），GSE16716 （n=47），GSE17705（n=196），GSE17907（n=54），GSE18728（n=61），GSE19615 （n=115），GSE20194 （n=45），GSE20271 （n=96），GSE2034 （n=286），GSE20685（n=327），GSE20711 （n=90），GSE21653 （n=240），GSE2603 （n=99），GSE26971 （n=276），GSE2990（n=102），GSE31448 （n=71），GSE31519 （n=67），GSE32646（n=115），GSE3494（n=251），GSE37946（n=41），GSE41998 （n=279），GSE42568 （n=121），GSE45255 （n=139），GSE4611 （n=153），GSE5327（n=58），GSE6532（n=82），GSE7390（n=198），GSE9195（n=77）。

1.2 GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）數(shù)據(jù)庫(kù) GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)包含的內(nèi)容很豐富，可尋找差異基因和相似基因，分析腫瘤病人的生存情況，探索兩個(gè)基因在腫瘤及正常組織中的表達(dá)相關(guān)性。利用該數(shù)據(jù)庫(kù)，筆者分析了基因ITSN1和HER2在乳腺癌中的表達(dá)情況。該數(shù)據(jù)庫(kù)中保存了TCGA和GTEx兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的樣本信息，本研究利用其中的1 085例乳腺癌患者和291例正常對(duì)照組進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 ITSN1 mRNA表達(dá)水平與乳腺癌患者總?cè)巳侯A(yù)后的關(guān)系 首先，通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)ITSN1 mRNA高表達(dá)的乳腺癌患者具有更好的（P=1.3e-07）無復(fù)發(fā)生存（圖 1B），但不影響患者（P=0.44）的總生存（圖1A）。

圖1 ITSN1 mRNA表達(dá)水平與乳腺癌患者總?cè)巳篛S、RFS的關(guān)系Fig 1 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and OS,RFS in breast cancer patients

2.2 ITSN1 mRNA表達(dá)水平與不同HER2狀態(tài)乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)不同HER2狀態(tài)對(duì)乳腺癌患者分類，ITSN1mRNA的表達(dá)量主要影響患者的無復(fù)發(fā)生存。ITSN1mRNA的低表達(dá)提示HER2陽(yáng)性（P=0.007 2）乳腺癌患者更好的無復(fù)發(fā)生存（圖2C），ITSN1mRNA的高表達(dá)提示HER2陰性（P=9e-05）乳腺癌患者更好的無復(fù)發(fā)生存（圖2D）。但無法預(yù)測(cè)患者的總生存，HER2陽(yáng)性（P=0.69），HER2 陰性（P=0.14）（圖2A、2B）。

圖2 ITSN1mRNA表達(dá)水平與不同HER2狀態(tài)乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig 2 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and prognosis of breast cancer patients in different HER2 status

2.3 ITSN1 mRNA表達(dá)水平與各亞型乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 進(jìn)一步分析看到，ITSN1 mRNA的低表達(dá)預(yù)示Her-2擴(kuò)增型乳腺癌（P=0.008 5）更好的總生存（圖 3 C），而在 luminal A（P=0.17），luminal B（P=0.49），基底細(xì)胞型（P=0.24）乳腺癌中沒有這種預(yù)測(cè)價(jià)值（圖3 A、3 B、3 D）。

圖3 ITSN1 mRNA表達(dá)水平與各亞型乳腺癌患者OS的關(guān)系Fig 3 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and OS of breast cancer patients

ITSN1 mRNA的表達(dá)水平與乳腺癌患者的無復(fù)發(fā)生存有一定關(guān)系。ITSN1 mRNA的高表達(dá)預(yù)示luminal A（P=0.000 46），luminal B（P=5.7e-05）乳腺癌患者更好的無復(fù)發(fā)生存（圖4 A，4 B），而在Her-2擴(kuò)增（P=0.12），基底細(xì)胞型（P=0.64）乳腺癌中沒有這種預(yù)測(cè)價(jià)值（4 C、4 D）。

圖4 ITSN1 mRNA表達(dá)水平與各亞型乳腺癌患者RFS的關(guān)系Fig 4 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and RFS in breast cancer patients

2.4 ITSN1 mRNA表達(dá)水平與不同淋巴結(jié)狀態(tài)乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的情況對(duì)乳腺癌患者分類，筆者發(fā)現(xiàn)ITSN1 mRNA的高表達(dá)提示淋巴結(jié)陰性（P=0.003 4）乳腺癌更好的總生存（圖5B），淋巴結(jié)陽(yáng)性（P=0.045）乳腺癌更好的無復(fù)發(fā)生存（圖5 C）。但無法預(yù)測(cè)淋巴結(jié)陽(yáng)性患者的總生存（P=0.93）（圖5 A）和淋巴結(jié)陰性患者的無復(fù)發(fā)生存（P=0.45）（圖5 D）。

圖5 ITSN1mRNA表達(dá)水平與不同淋巴結(jié)狀態(tài)乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系Fig 5 Relationship between ITSN1 mRNA expression level and prognosisof breast cancer patients in different lymph node status

2.5 基因ITSN1和HER2在腫瘤中的表達(dá)情況 ITSN1 mRNA的低表達(dá)在HER2陽(yáng)性/擴(kuò)增型乳腺癌患者中提示更好的預(yù)后，而在其他患者中ITSN1 mRNA的高表達(dá)提示更好的預(yù)后，這說明HER2在ITSN1 mRNA預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后方面發(fā)揮重要作用。為此筆者分別比較了基因ITSN1和HER2在多種癌癥中的表達(dá)。兩種基因在數(shù)十種癌癥中的表達(dá)既有升高也有降低，HER2在乳腺癌中的表達(dá)升高，ITSN1在乳腺癌中的表達(dá)降低（圖6 A、6 B）。這提示ITSN1在不同腫瘤中可能具有不同的功能，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

在乳腺癌（BRCA）中，通過對(duì)1 085例乳腺癌患者和291例正常對(duì)照組分析，箱式圖分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)HER2基因的表達(dá)高于正常乳腺組織（圖6C），ITSN1基因的表達(dá)低于正常乳腺組織（圖6 D），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 基因HER2和ITSN1在多種腫瘤及對(duì)應(yīng)正常組織中的表達(dá)(A,B)，兩種基因在乳腺癌及正常乳腺組織中表達(dá)的箱式圖（C,D）Fig 6 Expression of genes HER2 and ITSN1 in various tumors and corresponding normal tissues(A,B),box plots of expression of two genes in breast cancer and normal breast tissues(C,D)

3 討論

ITSN與調(diào)控細(xì)胞凋亡的線粒體途徑，促進(jìn)生存的PI3K途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和發(fā)育的RTK、Ras、MAPK途徑等密切相關(guān)，這些信號(hào)通路的改變都將嚴(yán)重影響細(xì)胞發(fā)揮正常的功能，更有可能導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。研究表明，過表達(dá)ITSN1可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[10]。

HER2基因在多種癌癥中擴(kuò)增，包括乳腺癌。HER2是重要的乳腺癌預(yù)后判斷因子，據(jù)報(bào)道，大約15%～25%的患者為HER2陽(yáng)性乳腺癌[11-12]。cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)中的Network板塊顯示，HER2基因在乳腺癌中的擴(kuò)增頻率為22.8%，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

筆者發(fā)現(xiàn)ITSN1 mRNA的高表達(dá)預(yù)示乳腺癌總?cè)巳焊玫念A(yù)后，然而，ITSN1 mRNA的低表達(dá)卻能夠提示Her-2擴(kuò)增型乳腺癌患者更長(zhǎng)的總生存，HER2陽(yáng)性乳腺癌患者更長(zhǎng)的無復(fù)發(fā)生存。對(duì)于這種現(xiàn)象，筆者提出了以下幾點(diǎn)猜想：HER2可以通過PI3K-AKT通路間接活化NF-kB，阻斷乳腺癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生存[13]。另外，PI3K/AKT通路在HER2陽(yáng)性乳腺癌中過度激活，這可能引起了患者總生存時(shí)間短及抗HER2治療耐藥[14]。ITSN1對(duì)PI3KAKT途徑具有調(diào)節(jié)作用，ITSN1與PI3K-C2β發(fā)生相互作用形成復(fù)合物，促進(jìn)AKT的磷酸化并激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞生存[15]。有研究報(bào)道，ITSN1與PI3KC2β在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中相互作用，沉默ITSN1可降低細(xì)胞生長(zhǎng)，過表達(dá)PI3K-C2β可逆轉(zhuǎn)ITSN1沉默導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)減慢[16-17]。

HER2與ITSN1存在相互作用并參與藥物反應(yīng)，這可能對(duì)腫瘤患者的生存及化療效果產(chǎn)生重要的影響?？傊?，HER2與ITSN1都可以調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路，該通路與細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、遷移和代謝等多個(gè)過程密切關(guān)聯(lián)。至于兩者如何通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT或其他信號(hào)通路而影響乳腺癌細(xì)胞的存活，具體作用機(jī)制有待于深入研究和驗(yàn)證。

筆者進(jìn)一步通過GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析，發(fā)現(xiàn)基因ITSN1和HER2在多種癌癥中異常表達(dá)，而在乳腺癌中，HER2基因的表達(dá)高于正常組織的2.34倍，ITSN1基因的表達(dá)低于正常組織的2.34倍。通過對(duì)1 085例乳腺癌患者和291例正常對(duì)照組的分析，我們發(fā)現(xiàn)ITSN1在乳腺癌中的表達(dá)明顯低于正常乳腺組織，HER2在乳腺癌中的表達(dá)顯著高于正常乳腺組織。

本研究首次利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析了ITSN1 mRNA的表達(dá)量對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的影響，我們發(fā)現(xiàn)ITSN1 mRNA的高表達(dá)能夠提示乳腺癌總?cè)巳焊L(zhǎng)的無復(fù)發(fā)生存（P=1.3e-07），但不影響患者的總生存（P=0.44）。進(jìn)一步將乳腺癌患者分類，發(fā)現(xiàn)ITSN1 mRNA高表達(dá)的luminal A（P=0.000 46），luminal B（P=5.7e-05），HER2 陰性（P=9e-05），淋巴結(jié)陽(yáng)性（P=0.045）乳腺癌患者具有更長(zhǎng)的無復(fù)發(fā)生存時(shí)間，高表達(dá)ITSN1 mRNA的淋巴結(jié)陰性（P=0.0034）乳腺癌患者具有更好的總生存。

總體來說，筆者發(fā)現(xiàn)單一考慮ITSN1 mRNA的表達(dá)，高表達(dá)組患者的預(yù)后好于低表達(dá)組。如果患者同時(shí)被鑒定為HER2陽(yáng)性/擴(kuò)增型乳腺癌，那么他的預(yù)后實(shí)際上差于低表達(dá)組。因此，筆者提出綜合考慮ITSN1和HER2評(píng)價(jià)乳腺癌患者預(yù)后的觀點(diǎn)，為精準(zhǔn)預(yù)測(cè)和精準(zhǔn)治療提供新的可參考的理論依據(jù)。