馬曉霞 ,孫 旸 ,馬 瑞 ,崔志坤 ,王 越 ,郭小芹 ,鄧為民
(1.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系,天津300070;2.武警后勤學(xué)院病原生物學(xué)教研室,天津300309;3.武警特色醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科,天津300163)
卵巢癌是婦科三大惡性腫瘤之一,病發(fā)隱匿,大部分患者確診時已屬晚期,因此卵巢癌是婦科腫瘤中病死率最高的惡性腫瘤。作為雌激素依賴性腫瘤,雌激素與雌激素受體(estrogen receptor,ER)的相互作用可促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展[1-3]。他莫西芬(tamoxifen,TAM)是目前臨床上治療乳腺癌最具代表性的抗雌激素藥物,卵巢癌與乳腺癌雖然同為雌激素依賴性腫瘤,但二者對抗雌激素治療反應(yīng)不同。約2/3 ERα陽性的乳腺癌患者對TAM治療有效,而卵巢癌患者有40%~60%表達(dá)ERα,但僅有7%~18%的患者對抗雌激素治療有效,因此,探討卵巢癌在抗雌激素治療中發(fā)生耐藥的機制具有重要意義[4]。IL-6是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的一種炎癥性細(xì)胞因子,臨床資料顯示,卵巢癌患者IL-6的高表達(dá)與不良預(yù)后及化療敏感性差密切相關(guān)[5-6]。本課題組研究發(fā)現(xiàn),卵巢癌細(xì)胞自分泌IL-6的水平與其對TAM的敏感性呈負(fù)相關(guān)。不分泌IL-6的A2780細(xì)胞對TAM敏感;而高分泌IL-6的CAOV3細(xì)胞對TAM耐藥[7]。IL-6是否影響卵巢癌細(xì)胞對TAM的敏感性?本研究對內(nèi)源性及外源性IL-6在誘導(dǎo)卵巢癌抗雌激素治療耐藥中的作用進(jìn)行初步研究,從而為解決卵巢癌內(nèi)分泌治療耐藥這一難題提供新的思路。
1.1 實驗材料、試劑 二甲基亞砜(DMSO):Sigma公司產(chǎn)品;噻唑藍(lán)(thiazolyblue,MTT):Sigma公司產(chǎn)品。美國GIBCO公司產(chǎn)品:RPMI/1640培養(yǎng)基、活性碳處理的FBS(sFBS);中美合資蘭州民海生物工程有限公司產(chǎn)品:胎牛血清(FBS);美國R&D公司:重組人IL-6、人IL-6 ELISA試劑盒;美國Invitrogen公司產(chǎn)品:LipofectamineTM2000、G418;TaKaRa 產(chǎn)品:M-MLV(RNase H-)逆轉(zhuǎn)錄酶、2×Premix Taq;100bp DNALadderMarker產(chǎn)自天根生化科技有限公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢腺癌細(xì)胞(A2780)和人乳突狀卵巢腺癌細(xì)胞(CAOV3)均為美國ATCC公司產(chǎn)物,前者購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,后者為本室保留。前者用含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng),后者用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),該培養(yǎng)液含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。
1.2.2 基因轉(zhuǎn)染克隆的篩選與鑒定 A2780細(xì)胞不分泌IL-6但表達(dá)其受體,而CAOV3細(xì)胞高表達(dá)IL-6及其受體。前期工作[7]獲得中度和高度表達(dá)IL-6的2個A2780細(xì)胞克隆(A2780/ssIL-6M和A2780/ssIL-6H)及A2780/pcDNA3.1+。本研究將帶有反義IL-6 cDNA的表達(dá)載體pcDNA3.1+/asIL-6轉(zhuǎn)染至CAOV3細(xì)胞中,細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,應(yīng)用G418(濃度為600 μg/mL)進(jìn)行加壓篩選獲得的陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆經(jīng)擴大培養(yǎng)后分別收取培養(yǎng)上清和細(xì)胞進(jìn)行ELISA和RT-PCR鑒定,獲得IL-6中度和高度抑制表達(dá)的2個CAOV3細(xì)胞克?。–AOV3/asIL-6Mi和CAOV3/asIL-6Hi)。同時將空載體轉(zhuǎn)染至CAOV3細(xì)胞作為陰性對照,為CAOV3/pcDNA3.1+。
1.2.3 IL-6的ELISA檢測 取對數(shù)生長期的上述卵巢癌細(xì)胞,調(diào)整各種細(xì)胞濃度為1×105/mL,接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,1 mL/孔,37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后,收集培養(yǎng)上清,按照ELISA試劑盒的說明書檢測培養(yǎng)上清中IL-6的含量。
1.2.4 RT-PCR反應(yīng) 總RNA的提取的流程參照TRizol試劑(美國Invitrogen)說明書。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件參照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行,引物序列IL-6 如 下 :IL-6:forward 5′-TTGACAAACAAA TTCGGTACA-3′,reverse 5′-GAGGTGCCCATGC T ACA-3′(497 bp);β -actin:sense5′-TGGAATCCT GTGGCATCCATGAAAC-3′,antisense 5′-TAAAACG CAGCTCAGTAACAGTCC-3′(350 bp)。PCR反應(yīng)體系:cDNA 1.0 μL,2×PremixTaq 10 μL,上、下游引物各10 pmol,加雙蒸水至總體積20 μL。PCR反應(yīng)的程序如下:預(yù)變性,94 ℃ 5 min;變性,94 ℃ 30 s;退火,59℃45 s;延伸,72℃1 min,設(shè)定34個循環(huán)。反應(yīng)終止時,吸取5 μL PCR反應(yīng)液在濃度為12 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。結(jié)果使用Quantity One軟件(Bio-Rad公司)分析,內(nèi)參是β-actin,使用靶基因/β-actin的光密度比值對mRNA進(jìn)行相對定量。
1.2.5 MTT試驗檢測細(xì)胞活性 應(yīng)用終濃度50ng/mL IL-6作用于A2780細(xì)胞,連續(xù)處理10 d,期間每2 d更換1次新鮮的培養(yǎng)液并加入相同濃度的IL-6,經(jīng)上述處理的細(xì)胞命名為IL-6預(yù)處理的A2780細(xì)胞(A2780/preIL-6細(xì)胞)。將A2780/preIL-6,A2780細(xì)胞分別接種到 96 孔板中(4×104/mL),100 μL/孔,37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,更換含有50 mL/L FBS的培養(yǎng)液,A2780/preIL-6細(xì)胞先加入20 μL終濃度為50 ng/mL的IL-6,然后與A2780細(xì)胞一起分別加入不同濃度的TAM(0.1、1、10、100、1 000 nmol/L),30 min后加入雌二醇(E2終濃度為1 nmol/L)。每個濃度設(shè)5個平行孔,并以TAM的稀釋液乙醇作為對照。37℃、50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)48 h后,在結(jié)束培養(yǎng)前4 h離心棄上清后加入 MTT 溶液(0.5 g/L,PBS配制),于 37℃、50 mL/L CO2孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h,離心棄MTT溶液后加入DMSO 100 μL/孔,充分振蕩至細(xì)胞內(nèi)的紫藍(lán)色結(jié)晶完全溶解,置酶標(biāo)儀上測定波長為490 nm時的吸光度(A)值。同時,內(nèi)源性過表達(dá)IL-6的A2780/ssIL-6及抑表達(dá)IL-6的CAOV3/asIL-6細(xì)胞,同樣采取上述方法檢測其細(xì)胞活性。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,最終結(jié)果以±s表示。兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LDS法,P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。
2.1 asIL-6基因轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞克隆篩選的鑒定 由圖1a可見,與空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAOV3/pcDNA3.1+相比,IL-6中、高抑制表達(dá)的2個CAOV3細(xì)胞克隆,其IL-6分泌水平分別下降了63.82%和75.69%(P<0.01),命名為 CAOV3/asIL-6Mi和 CAOV3/asIL-6Hi細(xì)胞,而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAOV3與空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAOV3/pc DNA3.1+相比IL-6分泌水平無明顯差異。上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的IL-6 mRNA水平與其分泌水平相一致(圖1b)。
圖1 asIL-6基因轉(zhuǎn)染CAOV3細(xì)胞克隆的IL-6表達(dá)水平Fig 1 ThelevelofIL-6expressioninasIL-6-transfectedCAOV3cell
2.2 外源IL-6可以誘導(dǎo)A2780細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥 由圖2可見,經(jīng)不同濃度的TAM(0.1、1、10、100、1 000 nmol/L)作用后,A2780/preIL-6 細(xì)胞增殖水平均顯著高于A2780細(xì)胞(均P<0.05)。說明外源性IL-6可以誘導(dǎo)A2780細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥。
圖2 外源性IL-6影響A2780細(xì)胞對他莫西芬的敏感性(MTT法)Fig 2 MTT assay for the effect of exogenous IL-6 on the sensitivity of A2780 cells to tasmoxifen
2.3 內(nèi)源性IL-6影響卵巢癌細(xì)胞對TAM的敏感性 如圖3a所示,經(jīng)不同濃度TAM作用后,A2780/ssIL-6M和A2780/ssIL-6H細(xì)胞的增殖水平均較空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞A2780/pcDNA3.1+明顯增加(均P<0.05),與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞A2780和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞A2780/pcDNA3.1+比較,細(xì)胞增殖水平無明顯差異。表明內(nèi)源性過表達(dá)IL-6可誘導(dǎo)A2780細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥。而抑制內(nèi)源性IL-6表達(dá)可恢復(fù)CAOV3細(xì)胞對TAM的敏感性,如圖3b所示,與空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAOV3/pcDNA3.1+相比,CAOV3/asIL-6Mi和CAOV3/asIL-6Hi細(xì)胞增殖水平均顯著下降(均P<0.05)。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAOV3和空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞CAOV3/pcDNA3.1+相比,細(xì)胞增殖水平無明顯差異。上述結(jié)果提示IL-6可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥。
圖3 內(nèi)源性IL-6影響卵巢癌細(xì)胞對他莫西芬的敏感性(MTT法)Fig 3 MTT assay for the effect of endogenous IL-6 on the responsiveness of ovarian cancer cells to tamoxifen
卵巢癌的發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌列居婦科惡性腫瘤第3位,而病死率在女性生殖系統(tǒng)癌癥中高居首位。作為一種雌激素依賴性腫瘤,流行病學(xué)表明雌激素替代治療可增加卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險;與正常絕經(jīng)后婦女相比,絕經(jīng)后卵巢癌患者血清中雌激素水平更高。一直以來,他莫西芬是卵巢癌抗雌激素治療的首選藥物。抗雌激素藥物可作為配體競爭性地與ER結(jié)合,通過誘導(dǎo)ER構(gòu)象改變而使ER的DNA結(jié)合區(qū)不能與靶基因上的雌激素反應(yīng)元件(estrogen response element,ERE)結(jié)合,由此阻斷了雌激素的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)。但根據(jù)受體狀態(tài)進(jìn)行內(nèi)分泌治療的效果不佳[8-10],具體機制尚不清楚。
IL-6是一種多功能細(xì)胞因子,其與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。IL-6通過影響細(xì)胞的粘附性和活動力、血栓形成、腫瘤特異性抗原的表達(dá)及腫瘤細(xì)胞的增殖而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。臨床資料表明卵巢癌患者高表達(dá)IL-6,其腹水中的水平明顯高于血清,IL-6水平升高與卵巢癌的不良預(yù)后及化療敏感性差相關(guān)[5]。體外實驗證明IL-6可增加卵巢癌細(xì)胞的粘附性、趨化性及總侵襲力;卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6是一種潛在的前血管生成因子;并可通過促進(jìn)MMP-9分泌而提高其致瘤性[6,11]。目前,國內(nèi)外對IL-6在雄激素依賴性腫瘤前列腺癌細(xì)胞生長和抗雄激素治療中作用及相關(guān)機制的研究相對較多。對IL-6在雌激素依賴性腫瘤乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞生長中的作用報道較少,如有研究表明IL-6對乳腺癌細(xì)胞生長有抑制作用[12],但對其轉(zhuǎn)移卻有促進(jìn)作用;研究發(fā)現(xiàn)IL-6不僅可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長,同時還證明雌激素對卵巢癌細(xì)胞的促生長作用有部分是由IL-6介導(dǎo)的[13-14]。
本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),人卵巢癌細(xì)胞自分泌IL-6水平與其對TAM的敏感性呈負(fù)相關(guān),提示IL-6可能在卵巢癌內(nèi)分泌治療耐藥中發(fā)揮作用。本研究利用內(nèi)源性和外源性IL-6處理的卵巢癌細(xì)胞作為模型,觀察IL-6在卵巢癌細(xì)胞對TAM敏感性中的作用。結(jié)果表明,外源性IL-6和內(nèi)源性過表達(dá)IL-6均可明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖水平,提示IL-6可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥,而抑制內(nèi)源性IL-6表達(dá)則明顯降低卵巢癌細(xì)胞的增殖水平,表明抑制IL-6表達(dá)可恢復(fù)卵巢癌細(xì)胞對TAM的敏感性。
本研究從正反兩方面證實IL-6可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥,對IL-6在誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞對TAM產(chǎn)生耐藥中的作用進(jìn)行初步探討,不僅有助于幫助筆者預(yù)測治療的療效,而且有望為逆轉(zhuǎn)卵巢癌抗雌激素治療耐藥提供新的靶點。然而IL-6誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞抗雌激素治療產(chǎn)生耐藥的分子機制尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。