段克非，由 楊，田步先

腦出血(Cerebral hemorrhage，CH)是一種病情進(jìn)展快、致死致殘率高的臨床常見(jiàn)疾病[1]，它是各種原因?qū)е碌木植磕X組織占位性病變，釋放某些活性物質(zhì)，使周圍腦組織發(fā)生變性、壞死[2]。臨床數(shù)據(jù)顯示，高血壓性腦出血是主要的自發(fā)性腦出血，占自發(fā)性腦出血發(fā)生的80%左右[3]。多數(shù)生存者均遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損癥狀。目前CT和MRI等影像學(xué)方法已廣泛應(yīng)用到腦出血的診斷，但因需搬運(yùn)患者、操作復(fù)雜等弊端，發(fā)現(xiàn)一些對(duì)腦出血診斷和病情演變具有預(yù)測(cè)價(jià)值的血液生物學(xué)標(biāo)記物具有重要意義。

代謝組學(xué)(metabolomics)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后，致力于研究整個(gè)生物體的動(dòng)態(tài)代謝狀態(tài)、對(duì)低分子量代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析的一門學(xué)科[4]。該組學(xué)在分子層面上探討疾病導(dǎo)致的代謝物濃度變化，尋找與疾病相關(guān)的代謝標(biāo)記物，為臨床治療提供有力幫助。該技術(shù)應(yīng)用于多種疾病的診斷與預(yù)后，如糖尿病腎病[5]、結(jié)核病[6]、腫瘤[7]等疾病，然而應(yīng)用基于代謝組學(xué)分析的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)血漿代謝物指標(biāo)與腦出血的研究相關(guān)性相對(duì)罕見(jiàn)。因此本研究通過(guò)分析腦出血患者與正常對(duì)照者的代謝譜，尋找腦出血發(fā)病后的差異代謝物，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腦出血的發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供新的方向。

在本文中，高血壓性腦出血占絕大多數(shù)，根據(jù)頭部CT掃描發(fā)現(xiàn)腦出血的部位主要分布在殼核、腦葉、丘腦等區(qū)域。其導(dǎo)致腦出血發(fā)病的機(jī)制仍不明確，可能與氨基酸、肉堿等代謝循環(huán)障礙，加重血壓的升高相關(guān)，從而誘發(fā)腦出血的發(fā)生。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究主要納入2017年5月～2018年11月就診于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院部的患者，分為研究組和對(duì)照組。研究組入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合第4屆全國(guó)腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議[8]制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)及頭部CT掃描確診為腦出血患者；(2)均為自發(fā)性首次腦出血；(3)發(fā)病至入院行CT掃描檢查的時(shí)間<24 h。研究組排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腦梗死、顱內(nèi)腫瘤等其他疾病導(dǎo)致的出血轉(zhuǎn)化、靜脈竇血栓等引發(fā)的出血；(2)因外傷等其他原因引起的腦出血；(3)嚴(yán)重肝腎疾病及惡性腫瘤；(4)無(wú)法配合本次研究實(shí)施的患者。對(duì)照組入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)同期同年齡段健康體檢者；(2)無(wú)腦出血病史及其他嚴(yán)重疾病史。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬一院倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)，所有受試者均為自愿參與本研究，并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 專業(yè)的醫(yī)護(hù)人員根據(jù)統(tǒng)一方案對(duì)所有受試者進(jìn)行指尖血樣采集和樣品制備。所有受試者于隔夜空腹8 h以上，入院后未進(jìn)行用藥前采集首次指尖血，滴入串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB SCIEX 4000)檢測(cè)專用濾紙片的3個(gè)孔板中，形成直徑大于8 mm且分布均勻的血斑，晾干后送檢。應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)所有樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析(具體操作方法可參考相關(guān)文獻(xiàn)[9])，測(cè)得23種氨基酸、35種肉堿和35個(gè)對(duì)應(yīng)比值共93個(gè)代謝物指標(biāo)。詳細(xì)詢問(wèn)并記錄受試者的一般臨床資料(包括年齡、性別、高血壓病史、糖尿病史、吸煙史及飲酒史)。

1.2.2 278例患者均應(yīng)用80排160層螺旋CT進(jìn)行掃描，掃描參數(shù)設(shè)置為120 Kv，600 mA，矩陣512×512，層厚5 mm，層距5 mm。所有患者均在發(fā)病24 h之內(nèi)實(shí)施頭部CT掃描檢查，并對(duì)其出血部位、出血量進(jìn)行觀察，同時(shí)采用容積測(cè)量法對(duì)患者的血腫大小進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料分析 本研究納入278例患者，其中研究組為138例，對(duì)照組為140例?；颊叩囊话闩R床資料見(jiàn)表1，研究組和對(duì)照組之間的年齡、高血壓病、糖尿病、吸煙史及飲酒史有顯著性差異(P<0.05)，性別無(wú)顯著性差異(P>0.05)。受試者頭部CT示出血部位、出血量見(jiàn)表2。

表1 受試者一般臨床資料

注：a應(yīng)用卡方檢驗(yàn)；b應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)

表2 受試者出血量及出血部位

2.2 OPLS-DA模型 OPLS-DA回歸分析是一種預(yù)測(cè)性建模技術(shù)，采用該分析方法篩選腦出血組與正常對(duì)照組間差異顯著性代謝物，得到相應(yīng)的散點(diǎn)分布圖(見(jiàn)圖1)。由圖可見(jiàn)研究組和對(duì)照組能明顯分開(kāi)(R2Y=0.636、Q2Y=0.583)，說(shuō)明其預(yù)測(cè)能力和解釋能力較強(qiáng)。Permutation實(shí)驗(yàn)累計(jì)的R2和Q2(左下部)明顯低于原始的R2和Q2值(右下部)，可以證明OPLS-DA模型是穩(wěn)定的、有效的。[截距：R2(0.0，0.151)，Q2(0.0，-0.246)](見(jiàn)圖2)。

圖1 OPLS-DA散點(diǎn)圖(1：腦出血組：綠色；2：對(duì)照組：藍(lán)色)

圖2 Permutation實(shí)驗(yàn)(1：腦出血組：綠色；2：對(duì)照組：藍(lán)色)

2.3 篩選組間差異性代謝物 對(duì)血漿中93個(gè)代謝物指標(biāo)進(jìn)行篩選。篩選出滿足VIP>1.0、AUC>0.7及P<0.01條件的指標(biāo)，共23個(gè)(見(jiàn)圖3)。

2.4 篩選顯著差異代謝物 Logistic回歸分析是一種線性回歸分析模型，可以很好的說(shuō)明敏感的代謝物在研究組和對(duì)照組的差異。將圖3中的23個(gè)代謝物納入Logistic回歸分析篩選顯著差異代謝物(P<0.05)，最終有8個(gè)指標(biāo)納入模型，分別是Tyr、Orn/Cit、Phe/Try、Cit/Arg、C4/C8、C18：2、C26、C3DC。并得到回歸方程式Y(jié)=-1.332*C4/C8+6.519*Orn/Cit-18.297*Phe/Tyr+0.790*Cit/Arg-0.178*Tyr+5.411*C18：2+164.239*C26+81.491*C3DC+2.367。根據(jù)此方程式，我們計(jì)算一個(gè)新指標(biāo)W。8個(gè)代謝物及新指標(biāo)W在研究組和對(duì)照組的表達(dá)量見(jiàn)相關(guān)性矩陣(見(jiàn)圖4)和小提琴圖(見(jiàn)圖5)。

該圖可以看到各個(gè)代謝物之間的線性相關(guān)程度，紅色表示兩個(gè)變量呈正相關(guān)，而且色彩越深、圓形面積越大，表示變量相關(guān)性越大。

圖4 相關(guān)性矩陣圖

由左上至右下代謝物依次為W、Tyr、Phe/Tyr、Orn/Cit、Cit/Arg、C18：2、C26、C4/C8、C3DC。小提琴圖中每一個(gè)點(diǎn)代表個(gè)體統(tǒng)計(jì)量，各圖中間紅點(diǎn)所在縱坐標(biāo)為樣本中位數(shù)。比較研究組與對(duì)照組中位數(shù)的大小，可以反應(yīng)血漿代謝物在兩組間差異。此圖可以清晰的看出與對(duì)照組相比，研究組Cit/Arg、Orn/Cit、Tyr、肉堿(C3DC、C26、C18：2)含量較低，而Phe/Tyr、肉堿(C4/C8)含量較高

圖5 小提琴圖

圖6 ROC曲線

2.5 檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性 分析新指標(biāo)W對(duì)腦出血的預(yù)測(cè)價(jià)值。用ROC曲線下面積(AUC)的大小評(píng)價(jià)診斷效果，AUC越接近于1，說(shuō)明診斷效果越好。篩選出的8種代謝物曲線下面積值均大于0.7(見(jiàn)圖6)，說(shuō)明異常代謝物對(duì)疾病的診斷性有一定的準(zhǔn)確性。設(shè)定的新指標(biāo)W為8種代謝物的綜合性指標(biāo)，其AUC的大小為0.993，大于其他所有代謝物AUC，提示結(jié)合多種代謝物將會(huì)提高對(duì)疾病的診斷價(jià)值。

3 討 論

多年來(lái)，腦出血的發(fā)病率及病死率在全球范圍內(nèi)始終居高不下，尋找新的診治方案迫在眉睫。對(duì)于腦出血患者來(lái)說(shuō)，其在發(fā)病之后腦內(nèi)微小動(dòng)脈會(huì)出現(xiàn)不同程度的痙攣改變，將會(huì)導(dǎo)致患者在發(fā)病較短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)腦組織缺血缺氧，甚至腦組織壞死，如果不及時(shí)治療，則很可能會(huì)出現(xiàn)血腫范圍迅速擴(kuò)大，加重病情，甚至有危及生命的風(fēng)險(xiǎn)[10]。因此，如果及早的發(fā)現(xiàn)高靈敏性和特異度的腦出血的代謝物指標(biāo)，有可能為早期、快速、可靠診斷和預(yù)防提供有力幫助。

已有研究表明腦出血后興奮性氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)水平上升，而抑制性氨基酸(甘氨酸、γ-氨基丁酸)水平下降[11]。然而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦出血組：Cit/Arg、Orn/Cit、Tyr，C3DC、C26、C18：2含量較低，而Phe/Tyr、C4/C8含量較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

鳥氨酸循環(huán)是將機(jī)體各種代謝途徑中產(chǎn)生的氨轉(zhuǎn)換成尿素，經(jīng)尿液排出體外。在鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶、精氨酸代琥珀酸合成酶和精氨酸代琥珀酸裂解酶等關(guān)鍵酶的作用下，鳥氨酸、瓜氨酸、精氨酸相互轉(zhuǎn)化。同樣，研究發(fā)現(xiàn)[12]在精氨酸、瓜氨酸、一氧化氮之間也存在一種循環(huán)稱作瓜氨酸-一氧化氮循環(huán)。一氧化氮屬于一類重要的內(nèi)皮功能舒張調(diào)節(jié)因子，在血壓控制中起關(guān)鍵作用，其與高血壓的發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)[13]。本文研究結(jié)果顯示，腦出血患者Cit/Arg、Orn/Cit降低，其機(jī)制可能與上述兩個(gè)循環(huán)代謝障礙相關(guān)，從而導(dǎo)致血壓改變，同時(shí)一氧化氮代謝障礙可產(chǎn)生過(guò)多的氧自由基，加重血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[14]，加重出血的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)不對(duì)稱二甲基精氨酸(ADMA)是一氧化氮合酶的內(nèi)源競(jìng)性抑制劑可加快血管收縮，因此血壓明顯升高[15]，容易誘發(fā)腦出血。

苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一，屬芳香族氨基酸。苯丙氨酸在苯丙氨酸羥化酶的作用下轉(zhuǎn)化成酪氨酸，酪氨酸在酪氨酸羥化酶的作用下轉(zhuǎn)化成多巴胺能，生成去甲腎上腺素和腎上腺素。研究發(fā)現(xiàn)[16]，血液中苯丙氨酸水平增高，腦電圖異常率明顯增高，同時(shí)對(duì)腦血管產(chǎn)生中重度損傷，進(jìn)而造成腦出血的發(fā)生。Kofler等[17]研究表明在患有蛛網(wǎng)膜下腔出血的背景下，測(cè)量的色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的腦間質(zhì)水平顯著降低，且往往伴有情緒改變。本研究發(fā)現(xiàn)，在腦出血患者中Phe/Tyr升高，Tyr降低，其可能與苯丙氨酸代謝途徑中的某種關(guān)鍵酶缺乏或關(guān)鍵代謝通路障礙有關(guān)，其機(jī)制仍不明確，需要擴(kuò)大樣本繼續(xù)探查。此外，Hufner[18]和Felger[19]研究發(fā)現(xiàn)，在多巴胺能/去甲腎上腺素能途徑中，患抑郁癥的腫瘤患者中血液中Phe/Tyr往往升高。

人體內(nèi)的肉堿根據(jù)碳原子數(shù)量可分為長(zhǎng)鏈和短鏈?；鈮A。肉堿有重要的生理作用包括：(1)肉堿存在于肌細(xì)胞中的線粒體中，β氧化供能；(2)抗氧化作用；(3)肉堿也與參與免疫系統(tǒng)的功能有關(guān)，參與支鏈氨基酸代謝[20]。本文研究中，與對(duì)照組比較，腦出血組C3DC、C18：2、C26降低，而C4/C8升高。其原因可能是脂肪酸β氧化功能失調(diào)，出現(xiàn)微循環(huán)障礙[21]，進(jìn)而誘發(fā)腦出血。Catharina等[22]研究發(fā)現(xiàn)隨著血清左旋肉堿水平的增加，動(dòng)態(tài)收縮壓和舒張壓顯著增加，并且發(fā)現(xiàn)BP與游離左旋肉堿和長(zhǎng)鏈?；鈮A之間存在獨(dú)立的正相關(guān)性，血壓過(guò)高有可能誘發(fā)腦出血的發(fā)生。Soyer 等[23]發(fā)現(xiàn)左旋肉堿減少氧化應(yīng)激所致血管損傷，對(duì)腦出血后腦血管痙攣的消退有潛在益處。此外研究發(fā)現(xiàn)，短鏈?；鈮A與芳香族氨基酸代謝有關(guān)[24]。

綜上所述，Phe/Tyr、Tyr、Cit/Arg、Orn/Cit、C4/C8、C3DC、C18：2、C26等血漿代謝物指標(biāo)與腦出血的發(fā)病相關(guān)。然而，我們需進(jìn)一步明確這些物質(zhì)在腦出血發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制，為臨床治療提供新的前景。