王方　郝歡萌　逯宜

[摘要]目的：研究胰島素對大鼠牙周膜細胞增殖及其炎性因子表達的影響。方法：分離培養(yǎng)原代大鼠牙周膜細胞，在體外高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別加入濃度為0nmol/L、25nmol/L、50nmol/L和100nmol/L的胰島素，0nmol/L濃度為對照組，其余均為實驗組，用不同濃度的胰島素處理細胞后，MTT法檢測大鼠牙周膜細胞增殖水平變化;根據(jù)MTT實驗結(jié)果，選取25nmol/L濃度胰島素處理組為實驗組，進行炎性因子表達差異研究，實時定量RT-PCR檢測不同濃度胰島素處理后炎性因子IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ、IL-10的表達;ELISA法檢測IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ、IL-10含量;通過上述實驗驗證胰島素對牙周膜細胞增殖及對牙周膜細胞炎性因子表達的影響。結(jié)果：與對照組相比，隨著胰島素濃度的增高，抑制作用越明顯;在mRNA水平和蛋白水平，胰島素處理的實驗組牙周膜細胞，其炎性因子表達量均明顯增高（P<0.05）。結(jié)論：胰島素會抑制大鼠牙周膜細胞的增殖，且對牙周膜細胞的炎性因子表達有促進作用。

[關(guān)鍵詞]牙周膜細胞;胰島素;增殖;炎性因子;抑制作用

[中圖分類號]R329.2+8? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）10-0092-04

Abstract： Objective? To study the effect of insulin on the proliferation of rat periodontal ligament cells and the expression of inflammatory factors. Methods? Primary rat periodontal ligament cells were isolated and cultured in high glucose medium in vitro. The concentration of insulin was 0nmol/L， 25nmol/L， 50nmol/L and 100nmol/L. The control group was 0nmol/L. The rest were experimental groups. After treated with different concentrations of insulin， the proliferation level of rat periodontal ligament cells was detected by MTT assay. According to MTT test results， 25nmol/L insulin treatment group was selected as the experimental group， the difference of expression of inflammatory factors was studied. After treated with different concentrations of insulin， the proliferation level of rat periodontal ligament cells was detected by MTT test， and the expression of inflammatory factors IL-1β， PGE2， TNF-α， IFN-γ and IL-10 was detected by real-time quantitative RT-PCR. The contents of IL-1β， PGE2， TNF-α， IFN-γ and IL-10 were measured by ELISA. The effects of insulin on the proliferation of periodontal ligament cells and the expression of inflammatory factors in periodontal ligament cells were verified by the above experiments. Results? Compared with the control group， the inhibition was more obvious with the increase of insulin concentration， and the expression of inflammatory factors in periodontal ligament cells treated with insulin increased significantly at the level of protein and mRNA （P<0.05）. Conclusion? Insulin can inhibit the proliferation of rat periodontal ligament cells and promote the expression of inflammatory factors in periodontal ligament cells.

Key words： periodontal ligament cells; insulin; cell proliferation; inflammatory factors; inhibitory action

牙周膜細胞（periodontal ligament cell，PDLC）是牙周組織的重要組成部分，是具有多向分化潛能的一類細胞，在生物體內(nèi)發(fā)揮著多種不可替代的生物學功能[1]，也是參與牙周組織再生過程的主要細胞類型之一[2-3]。因此對牙周膜細胞的生物學行為研究是近年來牙周組織健康，牙周組織再生的熱點研究領(lǐng)域[4]。本文以大鼠原代牙周膜細胞為研究對象，在體外對其施加不同濃度胰島素，研究胰島素水平對大鼠PDLC細胞增殖及其炎性因子表達的影響。

1? 材料和方法

1.1 材料：DMEM培養(yǎng)液（Gibco，美國）、胎牛血清（Gibco，美國）、PBS（Invitrogen，美國）、2mM谷氨酰胺、100U/ml青霉素（Amersham，美國）、原代培養(yǎng)器具盒（眼科剪、眼科鑷、手術(shù)刀）、PrimeScript? RT Master Mix （Perfect Real Time）（Takara，中國）、SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes（Thermo Fisher，美國）。

1.2 儀器：光學顯微鏡（Leica SE，日本）、實時定量PCR儀（ABI7500，美國）、多孔板酶標儀（Bio-Tech，美國）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠原代牙周膜細胞獲取及培養(yǎng)：配置含20%胎牛血清、100mg/L青-鏈雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)組織塊法獲取大鼠原代牙周膜細胞。1周后觀察，有細胞爬出，每3d換液1次。待原代細胞生長至80%融合時，0.25%胰蛋白酶37℃消化，以1：3比例傳代培養(yǎng)。

1.3.2 細胞分組和處理：取生長狀態(tài)良好的第二代大鼠牙周膜細胞，消化細胞制成的細胞懸液，分別接種在96/24孔板中，每孔接種細胞密度分別為1×104/孔、1×105/孔，每組設3個重復孔。用10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)1d后，分別加入濃度為0nmol/L、25nmol/L、50nmol/L和100nmol/L的胰島素進行處理，隔天換液，維持培養(yǎng)液中胰島素濃度。對照組培養(yǎng)液不添加胰島素，換液頻率與實驗組保持一致。

1.3.3 MTT檢測細胞增殖：在相同培養(yǎng)條件下，分別在0d、12h、1d、2d、3d、5d、7d的培養(yǎng)時間點，取上述96孔板中培養(yǎng)的細胞，在每孔加入配制好的MTT（5mg/ml）20?l，放入細胞培養(yǎng)箱中孵育4h，吸棄培養(yǎng)基后加入DMSO 100?l，避光震蕩15min，充分溶解晶狀物，用酶標儀檢測各孔在490nm處的吸光度OD值，繪制不同時間點實驗組和對照組牙周膜細胞的生長曲線。

1.3.4 實時定量PCR檢測原代細胞炎性因子mRNA的表達：根據(jù)MTT實驗結(jié)果選取25nmol/L濃度胰島素培養(yǎng)的牙周膜細胞，在培養(yǎng)第3天收集實驗組和對照組細胞總RNA，按照Takara micro RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參進行實時定量PCR實驗測定。炎性因子IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ、IL-10實時定量PCR引物序列如表1。

實時定量PCR檢測反應體系（20μl）：5×SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes 4μl，10μmol/L的上、下游引物各0.2μl，cDNA模板2μl，ddH2O 13.6μl。反應條件：94℃ 5 min;94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 2min，35個循環(huán);72℃ 10min。實驗結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，對各組實驗結(jié)果進行歸一化處理，采用相對定量法，表達量用GAPDH的倍數(shù)表示，用2-ΔΔCt法計算。

1.3.5 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液中炎性因子的表達：采用ELISA試劑盒（96T，武漢華美生物） 分別對培養(yǎng)第7天培養(yǎng)液中的IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ、IL-10含量進行檢測，實驗步驟和操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行，最后用酶標儀測定各炎性因子在細胞培養(yǎng)液中的濃度，繪制標準曲線，并根據(jù)標準曲線讀取稀釋后樣本中各細胞因子的濃度，然后再按稀釋倍數(shù)計算其實際濃度。

1.4 統(tǒng)計學分析：使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，行t檢驗，P<0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2? 結(jié)果

2.1 大鼠原代牙周膜細胞培養(yǎng)：組織塊法培養(yǎng)1周后，用20倍顯微鏡觀察細胞生長狀況，大鼠原代牙周膜細胞呈長梭形，生長狀態(tài)良好。見圖1。

2.2 MTT檢測細胞增殖：培養(yǎng)0d、12h、1d、2d、3d、5d、7d的牙周膜細胞MTT實驗結(jié)果顯示：在不添加胰島素干擾時，牙周膜細胞的增殖狀況良好，0～4d增殖速度較快，4～7d增殖趨于平穩(wěn)，給予低濃度胰島素干擾時（25nmol/L），細胞增殖速度較對照組明顯降低（P<0.05），給予高濃度胰島素時（50nmol/L、100nmol/L），細胞增殖受到明顯抑制。在培養(yǎng)的第2天增殖曲線就已趨于平緩。見圖2。

2.3 實時定量PCR檢測原代細胞炎性因子mRNA的表達：MTT實驗結(jié)果表明低濃度胰島素干擾時（25nmol/L），細胞增殖速度較對照組明顯降低，而高濃度胰島素時（50nmol/L、100nmol/L），細胞增殖受到明顯抑制，為了避免多重因素對實驗結(jié)果的干擾和影響，對炎性因子表達的研究選取低濃度胰島素（25nmol/L）刺激條件。與對照組相較，細胞培養(yǎng)液中炎性因子IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ在胰島素刺激下表達量均有不同程度的升高（P<0.05），與實時定量結(jié)果相符。而IL-10在細胞培養(yǎng)液中的表達略有下降。實時定量PCR檢測結(jié)果見圖3。

2.4 ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中炎性因子的表達：低濃度胰島素（25nmol/L）實驗組與對照組相較，細胞培養(yǎng)液中炎性因子IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ在胰島素刺激下表達量均有不同程度升高（P<0.005），與實時定量結(jié)果相符。而IL-10在細胞培養(yǎng)液中的表達略有下降（P<0.001）。見圖4。

3? 討論

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是臨床上最為常見的牙周組織慢性炎癥性疾病，與牙周炎相關(guān)的炎性細胞因子多達數(shù)十種[5-8]。牙周膜細胞是牙周組織的重要組成部分，其生理活動在牙周健康維持方面有不可替代的作用和生物學意義[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β、PGE2均與牙周病免疫破壞密切相關(guān)，如參與刺激骨吸收，誘導蛋白酶產(chǎn)生，抑制膠原、非膠原的合成[10-11]。也有證據(jù)表明牙周炎模型大鼠的IL-1β、PGE2水平均明顯高于健康大鼠，在牙周炎的發(fā)展過程中，其濃度隨著牙周炎癥程度的加重而相應增高[12]，IL-1β、PGE2在一定程度上又可以促進炎癥發(fā)展。國內(nèi)學者研究結(jié)果顯示IL-10的水平與牙周炎呈負相關(guān)，提示IL-10在牙周炎癥組織中可能是一種抗炎因子[13]。此外Carey、Yeganegi等人的研究也證實IL-10濃度升高可抑制免疫活性細胞表達及分泌炎癥細胞因子，從而抑制炎癥反應[14-15]。

炎癥是糖尿病和牙周炎的共同病理基礎(chǔ)[16]，糖尿病患者體內(nèi)的胰島素水平紊亂，在一定程度上加重了患者患牙周炎/慢性牙周炎的風險[17]，與此同時，牙周組織細胞炎性因子的表達，使二型糖尿病患者的血糖水平得不到有效的控制[18]。在體內(nèi)，牙周組織周圍炎性因子的來源一部分是牙周感染過程中產(chǎn)生的，隨牙周破損潰爛進入到體內(nèi)循環(huán)，進一步引起全身性的炎癥反應和免疫應答，在一定程度上能夠促使糖尿病患者產(chǎn)生胰島素抵抗癥狀[19]。文獻研究同時證實牙周感染可反作用于血糖控制，導致牙周病和糖尿病兩者之間出現(xiàn)惡性循環(huán)[20]。但胰島素濃度水平的高低對牙周細胞本身是否存在影響尚未見報道。結(jié)合上述已有的文獻研究，本文將研究目標鎖定在體外胰島素水平對牙周膜細胞生理活動的影響，主要以牙周膜細胞及其炎性因子表達水平為表征手段，觀察在正常培養(yǎng)條件下，不同濃度胰島素對牙周膜細胞增殖和炎性因子表達水平的影響。相較于體內(nèi)復雜環(huán)境，體外環(huán)境對細胞的影響是相對獨立和有針對性的，在實驗設計上盡可能少的引入能夠?qū)嶒灲Y(jié)果產(chǎn)生影響的因素，因此，筆者的實驗結(jié)果僅在一定胰島素濃度范圍內(nèi)觀察了牙周膜細胞生理活動的影響，在實驗限定條件下反映胰島素與牙周膜細胞之間的單向作用關(guān)系。

與對照組相比，在0～100nmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著胰島素濃度的增高，胰島素對細胞增殖的抑制作用越明顯;MTT實驗結(jié)果表明低濃度胰島素干擾時（25nmol/L），細胞增殖速度較對照組明顯降低，而高濃度胰島素時（50nmol/L、100nmol/L），細胞增殖受到明顯抑制，為了避免多重因素對實驗結(jié)果的干擾和影響，對炎性因子表達的研究選取低濃度胰島素（25nmol/L）刺激條件。在mRNA水平和蛋白水平，胰島素處理的實驗組牙周膜細胞，其炎性因子IL-1β、PGE2、TNF-α、IFN-γ表達量均明顯增高，對抗炎細胞因子IL-10的表達無顯著影響，與對照組相比在mRNA水平無明顯差異，在蛋白水平略有下降。因此，筆者得出以下結(jié)論：胰島素濃度小于100nmol/L時，胰島素濃度的增高會抑制大鼠牙周膜細胞的增殖，低濃度胰島素（25nmol/L）對牙周膜細胞的促炎性因子表達有促進作用。

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[收稿日期]2019-07-12

本文引用格式：王方，郝歡萌，逯宜.胰島素對大鼠牙周膜細胞增殖及其炎性因子表達的影響[J].中國美容醫(yī)學，2019，28（10）：92-95.