朱 瑞，張成鑫，王會(huì)平，李 鑫，沈志明，孫 飛，儲(chǔ)誠(chéng)豪，葛圣林

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease, CHD)近年來(lái)在外科治療策略上獲得了極大的進(jìn)展，尋找能夠獨(dú)立預(yù)測(cè)CHD患者術(shù)后預(yù)后的預(yù)測(cè)因子對(duì)術(shù)前危險(xiǎn)分層評(píng)估具有重要意義[1]。單核細(xì)胞在CHD的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色，血液中單核細(xì)胞黏附于活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)內(nèi)皮間隙浸潤(rùn)至內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬內(nèi)膜下脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞和脂質(zhì)斑塊，激活先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[2]，繼而表達(dá)一系列炎癥因子與基質(zhì)金屬蛋白酶，導(dǎo)致粥樣斑塊的不穩(wěn)定性和血管再狹窄[3]。研究表明CHD進(jìn)展伴隨著外周血經(jīng)典單核細(xì)胞向CD16+單核細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)變[4]，而中間型單核細(xì)胞(CD14++CD16+)增多與CHD患者主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events,MACE)密切相關(guān)[5]。該研究旨在分析CD16+單核細(xì)胞對(duì)接受非體外循環(huán)冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(off-pump coronary artery bypass grafting,OPCABG)CHD患者術(shù)后預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，為術(shù)前評(píng)估預(yù)后危險(xiǎn)分層提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科接受OPCABG的CHD患者168例，術(shù)中因個(gè)體原因轉(zhuǎn)為體外循環(huán)下冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(CABG)7例，2年隨訪期間5例失訪，因非心源性死亡1例。最終符合本研究并完成隨訪過(guò)程155例，男125例，女30例，年齡47～75(62.87±5.57)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)及手術(shù)指征依據(jù)《2011版ACCF/AHA關(guān)于外科冠狀動(dòng)脈旁路移植治療指南》。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 術(shù)前存在感染或炎癥疾病病史；② 自身免疫疾病病史；③ 血液疾病或惡性腫瘤病史；④ 既往血運(yùn)重建史或其他手術(shù)后；⑤ 既往服用過(guò)激素；⑥ 合并瓣膜病、原發(fā)性心肌病、嚴(yán)重心力衰竭或腦血管疾??；⑦ 肝腎功能不全；⑧ 術(shù)中轉(zhuǎn)為CABG；⑨ 因非心源性死亡；⑩ 無(wú)法提供知情同意。本研究獲安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合《赫爾辛基宣言》，納入此研究患者均已簽署知情同意書。

1.2 臨床資料登記登記患者基本臨床資料及術(shù)前常規(guī)化驗(yàn)指標(biāo)，包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、高血壓、糖尿病、腦血管病史、吸煙史、家族史、既往服用藥物史、左心房前后徑(left atrial diameter, LAD)、左心室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter, LVEDD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)、血常規(guī)、肝腎功能、血脂四項(xiàng)、血糖、C-反應(yīng)蛋白(C-reaction protein, CRP)等。

1.3 單核細(xì)胞亞群流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)術(shù)前采集患者外周靜脈血3 ml于肝素抗凝管，3 h內(nèi)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取兩支流式管加入血樣本100 μl，一管加入抗體CD14-FITC、CD16-PE和CD45-PC5各10 μl，另一管為對(duì)照管，加入對(duì)應(yīng)同型對(duì)照抗體10 μl，震蕩搖勻后室溫下避光15 min；每管再分別加入溶血?jiǎng)?00 μl，震蕩搖勻后37 ℃水浴箱避光10 min；采用Beckman CytomicsTMFC-500系列流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)前進(jìn)行光流路質(zhì)量調(diào)控和熒光補(bǔ)償，控制各項(xiàng)指標(biāo)在質(zhì)量允許值范圍內(nèi)。每份標(biāo)本檢測(cè)獲取細(xì)胞10 000個(gè)以上，檢測(cè)數(shù)據(jù)以Listmode文件形式保存，采用CXP 流式分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過(guò)白細(xì)胞共同分化抗原CD45、單核細(xì)胞標(biāo)志性脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)受體CD14、FcγⅢ受體CD16對(duì)單核細(xì)胞群進(jìn)行分析[6]，根據(jù)前向角(FSC)、側(cè)向角(SSC)及CD45表達(dá)強(qiáng)度確定單核細(xì)胞群，再采取同型對(duì)照確定CD14與CD16表達(dá)強(qiáng)度的界值，將單核細(xì)胞分為經(jīng)典型(CD14++CD16-)、CD16+單核細(xì)胞2種單核細(xì)胞子集。根據(jù)本研究CHD患者CD16+單核細(xì)胞占比的三分位數(shù)進(jìn)行分組，低CD16+單核細(xì)胞組51例(≤32.05%)、中CD16+單核細(xì)胞組53例(32.05%～40.1%)和高CD16+單核細(xì)胞組51例(>40.1%)。

1.4 隨訪患者術(shù)后隨訪2年，以發(fā)生MACE作為此項(xiàng)研究隨訪觀察的終點(diǎn)，計(jì)算并登記發(fā)生MACE距手術(shù)當(dāng)天的時(shí)間。MACE定義：心源性死亡、再發(fā)心絞痛或心肌梗死、心力衰竭、非出血性卒中、隨訪期間需再次進(jìn)行冠狀動(dòng)脈血運(yùn)重建[非預(yù)期經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention, PCI)或CABG]。

2 結(jié)果

2.1 患者基線特征比較入選CHD患者155例中男125例(80.6%)，女3例(19.4%)，年齡47～75(62.87±5.57)歲。術(shù)后發(fā)生MACE的患者24例，其中心源性死亡10例，再發(fā)心肌梗死4例，心力衰竭7例，非出血性卒中2例，需再次行手術(shù)進(jìn)行血運(yùn)重建1例。MACE組年齡較大(P<0.001)，糖尿病史較多(P<0.05)，術(shù)前LVEF較低(P<0.001)，而CRP值及CD16+單核細(xì)胞占比較高(P<0.001)，術(shù)后呼吸機(jī)輔助時(shí)間與ICU停留時(shí)間均較長(zhǎng)(P<0.001)。見(jiàn)表1。

2.2 CD16+單核細(xì)胞三分位組比較流式檢測(cè)外周血CD16+單核細(xì)胞占比，W2象限為CD16+單核細(xì)胞，見(jiàn)圖1。高CD16+單核細(xì)胞組患者術(shù)前CRP(P<0.001)、術(shù)后ICU停留時(shí)間(P<0.05)及MACE發(fā)生率(P<0.001)均高于中、低CD16+單核細(xì)胞組，見(jiàn)表2。Kaplan-Meier生存分析顯示高CD16+單核細(xì)胞組術(shù)后MACE發(fā)生率(33.3%)明顯高于中(9.4%)、低CD16+單核細(xì)胞組(4.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log Rank=21.960，P<0.001)，見(jiàn)圖2。

2.3 CD16+單核細(xì)胞對(duì)MACE的預(yù)測(cè)價(jià)值通過(guò)單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)影響CHD患者術(shù)后預(yù)后的因素進(jìn)行分析，結(jié)果表明年齡、CRP、LVEF、呼吸機(jī)輔助時(shí)間、ICU停留時(shí)間和CD16+單核細(xì)胞占比與術(shù)后MACE發(fā)生相關(guān)(P<0.05)。經(jīng)多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)性別、BMI、吸煙史、高血壓史、糖尿病史、家族史、CRP等傳統(tǒng)心血管疾病危險(xiǎn)因素進(jìn)行校正，分析結(jié)果顯示CD16+單核細(xì)胞是CHD患者OPCABG術(shù)后發(fā)生MACE的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=1.071，95%CI：1.040～1.104，P<0.001)。見(jiàn)表3。

2.4 ROC曲線評(píng)估通過(guò)ROC曲線評(píng)估，CD16+單核細(xì)胞預(yù)測(cè)術(shù)后MACE的曲線下面積為0.786 (95%CI:0.687～0.884，P<0.001)，最佳截?cái)嘀?1.9%，靈敏度70.8%，特異度78.6%，證明術(shù)前CD16+單核細(xì)胞占比具有較好預(yù)測(cè)CHD患者OPCABG術(shù)后MACE的價(jià)值。CD16+單核細(xì)胞預(yù)測(cè)術(shù)后MACE的ROC曲線下面積僅次于ICU停留時(shí)間(AUC=0.899，95%CI:0.841～0.958，P<0.001)，高于呼吸機(jī)輔助時(shí)間(AUC=0.753，95%CI:0.640～0.865，P<0.001)等指標(biāo)。見(jiàn)圖3。

3 討論

CHD是由于冠狀動(dòng)脈發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化(ather-osclerosis,AS)導(dǎo)致冠脈狹窄或阻塞，引起心肌缺血、低氧或壞死的一種缺血性心臟病。AS本質(zhì)上是一種慢性炎癥，多種免疫細(xì)胞參與了動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。人類經(jīng)典型單核細(xì)胞(CD14++CD16-)占循環(huán)單核細(xì)胞池的85%，其余由中間型(CD14++CD16+)和非經(jīng)典型(CD14+CD16++)組成[7]。AS初期血液中經(jīng)典型單核細(xì)胞數(shù)量增加，黏附于活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞，浸潤(rùn)至血管內(nèi)膜下分化為巨噬細(xì)胞[8]，隨著AS的進(jìn)展，經(jīng)典型單核細(xì)胞向CD16+單核細(xì)胞亞群進(jìn)行轉(zhuǎn)變[4]，最新一項(xiàng)研究也證實(shí)單核細(xì)胞在機(jī)體穩(wěn)定期向炎癥期發(fā)展過(guò)程中經(jīng)歷了從經(jīng)典型(CD16-)到中間型(CD16+)和非經(jīng)典型(CD16++)的順序演變[9]。Kashiwagi et al[10]研究認(rèn)為CD16+單核細(xì)胞高計(jì)數(shù)表達(dá)與穩(wěn)定心絞痛患者AS斑塊的脆弱性密切相關(guān)。CD16+單核細(xì)胞在心室重塑過(guò)程中也扮演了重要角色，Czepluch et al[11]發(fā)現(xiàn)CD16+單核細(xì)胞在CHD患者發(fā)生心肌梗死時(shí)大量轉(zhuǎn)移至梗死部位，參與心肌修復(fù)與心室重塑。

表1 MACE組與非MACE組患者基線特征比較

ACEI：血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑；ARB：血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑；NSAIDs：非甾體類消炎藥；CCB：鈣離子拮抗劑；β-blocker:β受體阻滯劑；Statins：他汀類藥物；TC：總膽固醇；TG: 甘油三酯；LDL-C: 低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C: 高密度脂蛋白膽固醇；BUN：血尿素氮

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD16+單核細(xì)胞

A：低CD16+單核細(xì)胞組(≤32.05%)；B：中CD16+單核細(xì)胞組(32.05%～40.10%)；C：高CD16+單核細(xì)胞組(>40.10%)

表2 CD16+單核細(xì)胞三分位組臨床資料比較[M(Q1，Q3)]

圖2 CD16+單核細(xì)胞三分位組Kaplan-Meier生存分析

項(xiàng)目單因素Cox回歸HR(95%CI)P值多因素Cox回歸HR(95%CI)P值年齡1.148(1.048～1.257)<0.051.143(1.038～1.258)<0.05CRP1.061(1.026～1.097)<0.051.052(1.007～1.100)<0.05LVEF0.837(0.773～0.906)<0.0010.799(0.722～0.884)<0.001呼吸機(jī)輔助1.049(1.030～1.069)<0.0011.044(1.015～1.074)<0.05ICU1.012(1.007～1.017)<0.0011.016(1.009～1.023)<0.001CD16+單核細(xì)胞1.055(1.030～1.080)<0.0011.071(1.040～1.104)<0.001

圖3 CD16+單核細(xì)胞等指標(biāo)預(yù)測(cè)術(shù)后MACE的ROC曲線

心血管疾病危險(xiǎn)因素與先天性免疫系統(tǒng)激活引起的免疫學(xué)變化有關(guān)。單核細(xì)胞在CHD患者中表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性，外周血單核細(xì)胞水平升高是CHD的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[12]，更有研究[13]顯示MACE患者的單核細(xì)胞基線特征改變與CHD患者相似，都表現(xiàn)出中間型單核細(xì)胞水平較高，經(jīng)典和非經(jīng)典單核細(xì)胞向中間型單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Shantsila[14]指出單核細(xì)胞本質(zhì)上分為CD14+CD16-與CD14+CD16+兩種具有明顯不同作用的細(xì)胞子集，CD14+CD16-單核細(xì)胞促進(jìn)蛋白水解和炎癥進(jìn)展，而CD14+CD16+單核細(xì)胞具有拮抗炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用。CD16+單核細(xì)胞作為獨(dú)立的一類單核細(xì)胞子集，已被研究[10]證實(shí)可用于評(píng)估CHD患者冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的脆弱性。

研究[15]顯示在急性心肌梗死發(fā)生時(shí)中間型單核細(xì)胞(CD14+CD16+)的表達(dá)急劇升高，其表達(dá)水平與左心室心功能損傷程度及梗死面積具有一致性，同時(shí)在急性心肌梗死患者的梗死灶核心區(qū)發(fā)現(xiàn)了大量單核細(xì)胞聚集。在梗死區(qū)周圍聚集的單核細(xì)胞促進(jìn)白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子等炎癥細(xì)胞因子釋放，在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、心肌細(xì)胞凋亡、心力衰竭及心室重塑等病理生理過(guò)程中具有重要作用[12]。CHD患者術(shù)前CD16+單核細(xì)胞水平增加，拮抗心肌急性缺血所致的炎癥反應(yīng)，有利于心室重塑，這種過(guò)度動(dòng)員的CD16+單核細(xì)胞水平反映了CHD患者術(shù)前的心肌炎癥狀態(tài)，這可能是此類患者術(shù)后易發(fā)生MACE的原因。

本研究通過(guò)分析CHD患者CD16+單核細(xì)胞亞群占比、傳統(tǒng)心血管疾病危險(xiǎn)因素、在院臨床指標(biāo)等與術(shù)后發(fā)生MACE的關(guān)系，表明CD16+單核細(xì)胞是CHD患者OPCABG術(shù)后MACE的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，對(duì)于CHD患者術(shù)前評(píng)估預(yù)后危險(xiǎn)分層具有重要意義。