周軼凡，陳婷婷，程筱雯

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球最常見的癌癥之一，大約35%的CRC風險可歸因于遺傳因素[1]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)構成了人類基因組90%以上的遺傳變異，SNP可導致細胞異常分化進而促進腫瘤發(fā)展，在過去10年中，已發(fā)現(xiàn)超過60個SNP位點與CRC相關[2]。Nemo樣激酶(Nemo like kinase，NLK)是一種進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是絲裂原活化蛋白激酶[3]，有研究[4-5]表明NLK在多種腫瘤組織中表達異常，在肝癌和膽囊癌中高表達，而在肺癌、乳腺癌和卵巢癌中則低表達[6-8]。目前NLK與腫瘤的相關研究多集中在編碼基因的細胞信號通路的研究，尚未見關于NLK的SNP位點與CRC關系的文獻。此前有研究[9]在進行了1 000多例樣本和近400個有絲分裂激酶SNP位點分析后僅篩選出1個SNP位點與浸潤性上皮性卵巢癌的風險相關，即NLK基因的rs2125846。故該實驗擬通過病例-對照研究分析該SNP位點在人群中的分布特點，探討其與CRC發(fā)生風險的關系，為高危人群的CRC防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料本研究的所有受試者均來自安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院。病例對照研究中共納入55例CRC病例和50例健康對照。所有病例均通過組織病理學診斷并排除術前進行放化療或者合并糖尿病、腎病等自身免疫性疾病的患者。從健康體檢者中隨機選擇與病例組年齡和性別相匹配的人群作為對照組。兩組研究對象的一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學 將直徑為3 μm厚的組織切片置于防脫載玻片，然后進行免疫組化。首先修復抗原，然后逐滴加入過氧化氫以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，將該切片與多克隆抗NLK抗體在室溫下以1 ∶200的稀釋度溫育，后滴加通用型二抗在室溫孵育，最后進行顯色反應。

1.2.2標本采集及DNA提取 采集病例組及健康對照的空腹靜脈血。嚴格按照試劑盒(購自上海百傲公司)的說明書，從外周血白細胞中提取DNA，使用 NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀(美國Thermo公司)檢測DNA含量，測量吸光度(absorbance, A)值A260和A280，比率均在1.8～2.0。

1.2.3SNP基因分型 該實驗使用羅氏(美國Roche公司)高分辨率溶解曲線 (LightCycler ? 480， high resolution melting master，HRM )試劑盒進行實驗，使用機器為Roche LightCycler96熒光定量PCR儀。PCR在96孔板中以20 μl的體積進行，包括40～60 ng DNA，5 mol/L的每種引物，1.6 μl MgCl2，6.2 μl水和10 μl 2×ResoLight Mix。 按照以下反應條件進行：95 ℃、10 min； 95 ℃、10 s，45個循環(huán)；58 ℃、15 s；72 ℃、15 s。 通過在65～98 ℃下以每1 ℃ 20次采集的速率獲得HRM數(shù)據(jù)。

圖1 CRC組織中NLK的表達情況 ×200

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 20.0軟件進行分析，使用χ2檢驗來比較病例組和對照組之間的基本情況。使用非條件Logistic回歸模型分析不同遺傳模型與CRC的關聯(lián)，并計算優(yōu)勢比(adjusted odds ratio，OR)和95%置信區(qū)間(95%CI)。 AA表示野生純合基因型，AG表示雜合突變基因型，GG表示純合突變基因型。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NLK在結直腸組織中的表達情況免疫組化實驗結果顯示，CRC組織中NLK的表達水平高于相應的癌旁組織。見圖1。

2.2 NLK基因SNP位點rs2125846與CRC易感性的關聯(lián)性rs2125846多態(tài)性型別為AA、AG、GG，在對照組中的分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(χ2=1.02，P>0.05)。病例組中AA、AG、GG的發(fā)生頻率分別為41.8%、58.2%和0%；在對照組中，相應的數(shù)據(jù)分別為52.0%、36.0%和12.0%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.888，P=0.007 1)，即病例組與正常組之間NLK基因SNP位點rs2125846多態(tài)性分布不同。在共顯性模型中，攜帶AG基因型患CRC的OR=2.01，95%CI：0.898～4.496，在10%的置信水平上顯著，攜帶AG基因型的CRC發(fā)生風險是AA基因型的2.01倍。在隱性模型中，與AA基因型相比，攜帶G等位基因(GG+AG)的患者發(fā)生CRC的可能性是AA基因型的1.51倍(OR=1.51；95%CI：0.697～3.259)。見表1、2。

表1 NLK基因SNP位點rs2125846基因型分布

表2 病例組和對照組中NLK基因SNP位點rs2125846

2.3 NLK基因SNP位點rs2125846多態(tài)性與CRC發(fā)病風險關聯(lián)的分層分析根據(jù)常見臨床病理特征、患者年齡及CRC主要發(fā)生部位進一步對rs2125846多態(tài)性進行分層分析。在病例組中未檢測到rs2125846多態(tài)性與病理特征、患者年齡及CRC主要發(fā)生部位有統(tǒng)計學相關性。見表3。

3 討論

據(jù)全球癌癥年報統(tǒng)計，2018年發(fā)生超過180萬例新發(fā)CRC和CRC導致死亡881 000例，占癌癥病例和死亡人數(shù)的1/10?？傮w而言，CRC的發(fā)病率排名第3，但死亡率排名第2。在最近10年中，中國的CRC死亡率和發(fā)病率均有所增加[10]。由于早期缺乏特異性和敏感性的分子標志物，許多臨床患者在初步診斷時已被發(fā)現(xiàn)處于中晚期階段[11]。SNP是一種常見的遺傳變異，可導致不同的功能性產(chǎn)物而影響個體對疾病的易感性。因此，SNP可被視為預測包括CRC在內(nèi)的散發(fā)性腫瘤風險的生物標志物。在過去的30年中，較多SNP通過廣泛的全基因組關聯(lián)研究和候選基因關聯(lián)研究，確認與CRC風險相關聯(lián)[12]。由于CRC發(fā)生發(fā)展的機制復雜，新的CRC相關遺傳變異區(qū)域有必要進一步探索，以期尋求更有效的分子標志物和藥物作用靶點。越來越多數(shù)據(jù)表明NLK被認為是潛在的腫瘤抑制因子或致癌基因，NLK的沉默或上調(diào)可以為腫瘤提供有效的治療手段[13]。本研究中，免疫組化實驗結果顯示CRC組織中NLK的表達水平高于癌旁組織，該結果與之前的文獻結果一致，NLK的過度表達與較差的臨床病理參數(shù)相關，如晚期TNM分期、分化差、淋巴結和遠處轉(zhuǎn)移以及較高的CRC復發(fā)率[14]。NLK基因定位于人類染色體17p12，包含多個SNPs，其中 rs2125846位于NLK基因的第6個內(nèi)含子內(nèi)(2364A/G)，在2 364位點發(fā)生A—G的堿基替換。有研究[15]表明一些內(nèi)含子多態(tài)變體具有賦予疾病易感性的潛力，由于內(nèi)含子含有多種功能元件，包括內(nèi)含子剪接增強子和沉默子，以及調(diào)節(jié)可變剪接的順式作用RNA元件等，因此內(nèi)含子區(qū)域的SNP對靶基因可能比迄今所認為的有更大的影響力。

表3 NLK基因SNP位點 rs2125846多態(tài)性與CRC常見臨床病理學特征及年齡、腫瘤發(fā)生部位的關聯(lián)分析

本研究NLK基因的SNP位點rs2125846中，病例組中AA、AG、GG的發(fā)生頻率分別為41.8%、58.2%和0%；而在對照組中則相應為52.0%、36.0%和12.0%，病例組與正常組之間NLK-2364A/G基因型分布顯著不同(χ2=9.888，P=0.007 1)。在共顯性模型中，攜帶AG基因型患CRC的OR=2.01，95%CI：0.898～4.496，在10%的置信水平上顯著，攜帶AG基因型的CRC發(fā)生風險是AA基因型的2.01倍。在隱性模型中，與AA基因型相比，攜帶G等位基因(GG+AG)的患者發(fā)生CRC的可能性是AA基因型的1.51倍。rs2125846多態(tài)性與CRC發(fā)病風險關聯(lián)的分層分析中未檢測到患者NLK-2364A/G與年齡、CRC主要發(fā)生部位及常見臨床病理特征有統(tǒng)計學相關性，考慮其可能的原因有兩個：一是因為樣本量偏少，二是本次研究涉及的CRC相關風險因素及常見臨床病理特征偏少。接下來的實驗將擴大樣本量同時納入更多的CRC相關風險因素及常見臨床病理特征進行更進一步的分析，目前SNP rs2125846作用的具體機制尚不清楚，故后續(xù)實驗也將進行該位點的功能驗證。

總之，本研究在中國人群中鑒定了位于人類NLK基因內(nèi)含子內(nèi)的與CRC風險相關的新易感位點rs2125846。隨后需要進一步擴大樣本量，擴大種族和地理覆蓋范圍及進行功能驗證，以確認NLK基因?qū)RC發(fā)生風險的影響。