陳樂樂，張開光，葉 超，陳 思，曹一凡，張云鳳

中國是胃癌高發(fā)國家，近年來發(fā)病率和死亡率呈一定的上升趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的生存健康[1]。目前已知的生物標(biāo)志物對胃癌患者的預(yù)后診斷價值都不太理想，因此尋找新型胃癌相關(guān)的生物標(biāo)志物對胃癌的預(yù)后判斷非常重要。LETM1作為一種線粒體內(nèi)膜蛋白參與調(diào)節(jié)惡性腫瘤的進展，引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前研究已經(jīng)證實LETM1與結(jié)腸癌[2]、食管癌[3]、膀胱癌[4]等多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，但其在胃癌組織中的表達水平及作用機制還尚不明確，因此，該研究的目的是通過檢測LETM1在胃癌組織水平中的表達情況，分析其對診斷胃癌患者預(yù)后的預(yù)測價值，為胃癌的預(yù)后診斷提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽省立醫(yī)院2012年7月～2015年12月收治入院并行手術(shù)治療的胃癌患者的臨床病理資料，通過電話的方式進行隨訪，最終有114例胃癌患者納入本次研究，患者術(shù)前均未行放化療治療。所有標(biāo)本均來自于本院病理科標(biāo)本庫，由病理科醫(yī)師重新閱片，收集其對應(yīng)的胃癌組織蠟塊。

1.2 受檢組織LETM1的檢測鼠抗LETM1單克隆抗體購于美國Abnova公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購于上海Gene Tech公司。鼠抗人LETM1單克隆抗體按1 ∶300稀釋，免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(streptavidin-perosidase，SP)進行處理，并嚴(yán)格按試劑盒說明書進行操作。最后由兩名對臨床病理信息不知情的病理科醫(yī)師對免疫組化結(jié)果進行評估。按照陽性細(xì)胞所占百分比并參考著色強度進行分級, 無明顯陽性細(xì)胞或染色較淺為(-)；陽性細(xì)胞數(shù)<25%, 顆粒棕黃色為(+)；陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%, 顆粒棕黃色為(++)；陽性細(xì)胞數(shù)>50%, 顆粒深棕色為()。將LETM1染色(-)及(+)納入低表達組，LETM1染色為()及()納入高表達組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間比較選用χ2或Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。利用Kaplan-Meier法進行生存分析，組間差異比較應(yīng)用Log-Rank，通過多因素回歸分析確定LETM1是否為影響胃癌患者的獨立預(yù)后因素。

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況114例胃癌患者中，男63例，女51例；手術(shù)時年齡≥60歲72例，<60歲42例。腫瘤>5 cm 46例，≤5 cm 68例。術(shù)后病理診斷證實：Ⅰ、Ⅱ期患者48例，Ⅲ、Ⅳ期患者66例。高、中分化53例，低分化61例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性及陰性患者分別為56例和58例。

2.2 胃癌組織中LETM1的表達免疫組化結(jié)果顯示，LETM1的表達定位在胃癌細(xì)胞線粒體內(nèi)，陽性表達呈棕褐色，胃癌組織陽性表達率為59.65% (68/114)，癌旁正常組織為12.28% (14/114)，兩者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 LETM1在同一患者胃癌組織和癌旁正常組織中的表達情況 ×200A：LETM1在胃癌組織中的表達；B：LETM1在癌旁正常組織中的表達

2.3 LETM1表達與臨床病理特征的關(guān)系LETM1與胃癌患者分化程度有關(guān)，低分化胃癌LETM1陽性表達率較高、中分化表達高，分別為71.70%和51.50%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。LETM1與臨床TNM分期有關(guān),Ⅲ～Ⅳ期LETM1陽性表達率較Ⅰ、Ⅱ期高，分別為71.21%和43.75%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，LETM1與是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者LETM1陽性表達率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者高，分別為69.64%和50.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) 。LETM1與患者的年齡、性別及腫瘤大小無關(guān)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.4 生存分析通過電話隨訪，最終有114例胃癌患者納入本次研究，隨訪時間為5～64個月，中位隨訪時間為33個月。到隨訪時間截止，共有65例患者存活，49例死亡。統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)114例患者中，LETM1蛋白高表達共68例，3年總體生存率為53.2%；LETM1低表達共46例，3年總體生存率為80.5%，上述兩者指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.097,P<0.05)。見圖2。

圖2 不同LETM1表達的生存曲線比較

表1 LETM1與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

表2 胃癌術(shù)后預(yù)后的單因素Cox分析

表3 影響患者預(yù)后的多因素Cox分析

2.5 胃癌患者的預(yù)后因素分析單因素分析結(jié)果顯示：LETM1蛋白表達水平、臨床分期、分化程度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小是影響胃癌患者預(yù)后的相關(guān)因素(P<0.05)；性別、年齡對胃癌患者預(yù)后無明顯影響(P>0.05)，見表2。

進一步COX多因素回歸分析顯示，LETM1表達是影響胃癌預(yù)后的獨立影響因素，是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度及臨床TNM分期亦是影響預(yù)后的獨立影響因素(P<0.05)。LETM1表達高、臨床分期晚、分化程度差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性均可導(dǎo)致患者預(yù)后不良。見表3。

3 討論

LETM1是一種極為保守的線粒體內(nèi)膜蛋白，參與線粒體基本代謝反應(yīng)的調(diào)節(jié)[4]，其改變可導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能明顯受損，引發(fā)膜的通透性增加、活性氧過多釋放及自噬作用的激活，導(dǎo)致細(xì)胞的破壞[5-7]。同時其作為線粒體內(nèi)膜蛋白還參與調(diào)節(jié)腫瘤的進展，有文獻報道LETM1可通過抑制線粒體的生成誘導(dǎo) Hela細(xì)胞壞死，此外，還通過免疫組化法對多種腫瘤組織進行染色處理，發(fā)現(xiàn)LETM1在肺癌、卵巢癌等多種腫瘤中呈高表達[8]，但其是否參與調(diào)控胃癌的進展目前還尚不明確。

本研究揭示了LETM1的表達水平與胃癌之間的關(guān)系，結(jié)果顯示胃癌組織中LETM1呈現(xiàn)出棕褐色顆粒樣深染，陽性表達強，而在癌旁正常組織僅呈淺色淡染，表達明顯較低或幾乎無表達。經(jīng)比較分析胃癌組織及癌旁正常組織的陽性表達率分別為59.65% 和12.28%，說明LETM1在兩者組織中存在差異性表達。但本次實驗有少許切緣正常的癌旁正常組織也呈高表達，通過與其他癌旁組織的對比聯(lián)合臨床資料的分析，推測這些呈強染色的癌旁正常組織很可能在早期就出現(xiàn)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，但由于術(shù)中快速病檢的時間限制以及傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物對一些細(xì)小的微轉(zhuǎn)移而不易有效察覺。進一步的研究分析顯示：與病理分化程度高、臨床Ⅰ～Ⅱ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的胃癌患者相比，病理分化程度低、臨床Ⅲ～Ⅳ期和伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌患者的LETM1陽性細(xì)胞數(shù)明顯升高，這些結(jié)果表明LETM1在胃癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用。

Chen et al[9]研究發(fā)現(xiàn)LETM1陽性表達與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)的臨床分期及病理程度分級密切相關(guān)，臨床分期越晚、病理分化越低時 LETM1表達陽性率越高，提示LETM1表達升高是HNSCC惡性程度增高、侵襲性增強、預(yù)后不良的表現(xiàn)。三陰性乳腺癌中LETM1過表達患者的10年總生存期和無病生存期均明顯低于LETM1低表達的患者[10]。本次研究結(jié)果顯示，LETM1高表達組的胃癌患者術(shù)后3年總體生存率明顯低于低表達組，且LETM1高表達組中位生存期與低表達組相比明顯縮短，說明LETM1高表達常提示術(shù)后預(yù)后不良，與在其他惡性腫瘤的研究結(jié)果高度一致，表明檢測LETM1表達對判斷胃癌預(yù)后也具有特定的參考意義。多因素回歸分析提示LETM1表達上調(diào)可作為影響患者預(yù)后的獨立危險因素，這進一步說明LETM1和胃癌預(yù)后之間存在一定的聯(lián)系，對評估和判斷胃癌患者的預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。

LETM1可激活多種信號通路參與癌癥的轉(zhuǎn)移和浸潤。腎癌細(xì)胞株中，抑制LETM1表達可引起β-連環(huán)蛋白、周期蛋白D1和c-Myc下調(diào)，進而導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移和侵襲顯著降低[11]。最近一項研究[12]顯示LETM1與ESCC中Cyclin D1和pAkt的表達呈正相關(guān)，表明LETM1可能通過改變PI3K/Akt信號傳導(dǎo)及細(xì)胞周期對腫瘤細(xì)胞進行調(diào)節(jié)。目前LETM1對胃癌細(xì)胞的調(diào)節(jié)機制尚不明確，仍需細(xì)胞功能實驗予以驗證。

本研究初步探討了LETM1在胃癌中的表達，并通過對患者預(yù)后的隨訪研究得出了有意義的臨床結(jié)果。然而本研究也有不足之處，一方面，由于臨床資料有限，本次納入研究的患者病理組織學(xué)類型均為腺癌，并未對其他少見類型的腫瘤分類納入本次研究，所以研究結(jié)果并不能代表所有的胃癌組織類型。另一方面，受客觀原因的限制，本研究僅采用免疫組化半定量的方法對114例胃癌患者的LETM1表達水平進行了評估，方法相對而言較為粗略，并不能完全代表LETM1的真實表達水平。但目前的初步研究結(jié)果仍支持進行進一步的細(xì)胞功能實驗判斷其對胃癌細(xì)胞生物行為的影響，從而更好的探究LETM1與胃癌的關(guān)系。

綜上，LETM1蛋白在胃癌組織中的表達率較高，陽性表達常提示預(yù)后不良，可將其作為判斷胃癌患者預(yù)后有價值的分子生物學(xué)指標(biāo)。