雍家慧，陳象遜，羅薇薇，楊明威，錢雯川，張冬娟，呂 銀，楊 林

宮頸癌是全球女性第四大常見惡性腫瘤，嚴重危害女性健康[1]。聯(lián)合放化療是中晚期宮頸癌的標準治療手段[2]。以順鉑為基礎的同步放化療方案使宮頸癌患者的生存獲益顯著增加，但30%～40%患者未能達到對同步放化療的完全反應[3]，同時鉑類耐藥是導致患者預后不佳的重要因素?；颊呋驑嫵傻牟町愂腔颊邔熜Ч町惖脑蛑籟4]。大量研究表明，MDR1(G26677T/A)基因存在G2677T/A多態(tài)性，它與紫杉醇的療效相關，2677GG基因型患者的總生存期差于GA、GT、TT、TA基因型患者；GSTP1(Ile105Val A/G)基因密碼子105A>G 變異使GST 對化療藥物的解毒能力下降，細胞內藥物量增加，療效較好；CDA(A79C)基因中的CDA79A/A或CDA79A/C型的晚期非小細胞肺癌患者在接受吉西他濱治療后有明顯生存獲益，其總生存期與攜帶CDA79C/C患者相比顯著延長(P<0.001)[5]；但MDR1(G26677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)三者基因多態(tài)性與紫杉醇、順鉑、吉西他濱對應宮頸癌化療敏感性的關系未見相關報道。本研究在此基礎上，通過檢測中晚期宮頸癌患者外周血中MDR1(G26677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)基因的表達情況，選用結果敏感度高的藥物作為實驗組的化療方案，從而更精準指導患者進行治療，可增加治療療效，改善預后。

1 材料與方法

1.1 病例資料2015年10月～2018年3月共收集46例患者，臨床分期為Ⅱb～Ⅳa期，心肺腎臟器功能正常，無其他惡性腫瘤病史，既往未行放化療。入組標準：① 年齡為18～80歲；② 經(jīng)病理證實、初治的中晚期(Ⅱb～Ⅳa)宮頸癌患者；③ 體力狀況(performance status，PS)評分0～1分，能耐受放化療，無嚴重合并癥，心肺功能良好；④ 患者自愿參加并簽署知情同意書。排除標準：① 既往有其他癌癥病史；② 伴隨其他惡性腫瘤。將患者隨機分為實驗組(n=23)與對照組(n=23)。實驗組患者年齡35～72(52.9±9.5)歲；鱗癌21例，腺癌1例，腺鱗癌1例；根據(jù)國際婦產科聯(lián)盟(Federation International of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)2000年的手術病理分期：Ⅱb期8例，Ⅲa期6例，Ⅲb期8例，Ⅳa期1例。對照組患者年齡44～68(53.1±6.7)歲；鱗癌22例，腺癌1例，腺鱗癌0例；Ⅱb期10例，Ⅲa期4例，Ⅲb期9例，Ⅳa期0例。兩組患者年齡(P=0.152)、組織學分級(P=0.339)以及臨床分期(P=0.294)等差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 方法

1.2.1標本采集及DNA提取 在每個化療周期開始前，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集宮頸癌患者外周靜脈血3 ml，根據(jù)上海生工公司基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，-20 ℃儲存。

1.2.2設計及合成引物 在美國國家生物技術信息中心提供的基因及單核苷酸多態(tài)位點(single nucleotide polymorphism，SNP)公共數(shù)據(jù)庫中，查詢MDR1(G2677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)基因全序列及3個SNP序列，設計引物，由上海生工公司合成引物，如表1所示。

表1 引物序列

1.2.3PCR反應 配制50 μl反應體系: 1 μl(濃度50 ng/μl)模板DNA，2 μl(濃度10 μmol/μl)上游引物，2 μl(濃度10 μmol/μl)下游引物，2×PCRMix 25 μl，超純水20 μl；反應條件: 94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)檢測聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)產物。純化PCR產物、測序，測序結果用DNASTAR軟件中的Seqman和SeqBuilder進行分析。

1.2.4化療方法 實驗組患者使用測序法對MDR1(G26677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)多態(tài)性進行檢測，根據(jù)檢測結果指導化療方案：對于MDR1(G26677T/A)檢測結果為GG型者，藥物敏感度較低，放棄選擇紫杉醇化療，而檢測結果為TT、TA、GA、GT、AA型，藥物敏感度高，選擇紫杉醇化療[6-7]；對于GSTP1(Ile105Val A/G)檢測結果為AA型者，藥物敏感度較低，放棄選擇鉑類化療，而檢測結果為AG、GG型，藥物敏感度高，選擇順鉑化療[8]；對于CDA(A79C)檢測結果為CC型者，藥物敏感度較低，放棄選擇吉西他濱化療，而檢測結果為AA、AC型，藥物敏感度高，選擇吉西他濱化療[9-10]。MDR1(G26677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)對應的紫杉醇、順鉑、吉西他濱敏感度三個均高，采用紫杉醇+順鉑化療方案；MDR1(G26677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)對應的紫杉醇、順鉑、吉西他濱敏感度三個均低，只采用放射治療。對照組化療方案[11]：給予紫杉醇+順鉑(TP)方案化療(詳細方案見表2)。21 d為1個化療周期，連續(xù)完成6個周期。

1.2.5放療方法 實驗組及對照組均進行放射治療，包括盆腔外照射及腔內照射。給予調強放射治療(intensity modulated radiation therapy, IMRT)外照射，DT50 Gy/25 f，每周5次；一般在外照射劑量達到30 Gy/15 f時配合腔內放療，劑量5～6 Gy/次，每周1次，總5～6次。腔內治療當天不行外照射治療。

1.3 初期療程判定標準根據(jù)藥物體內代謝試驗研究表明，按照1.2.4化療方案指導，通過對實驗組患者抽取外周血檢測對應基因型，來判定患者對應藥物敏感性，決定化療方案。6個療程結束后對患者進行隨訪，觀察兩組近期療效及化療藥物相關不良反應：① 療效評價根據(jù)實體瘤療效評價標準RECIST標準[11]：完全緩解(complete response，CR)、部分緩解(partial response，PR)、穩(wěn)定(stable disease，SD)和進展(progressive disease，PD)?？陀^緩解率(objective response rate，ORR)=(CR+PR)/(CR+PR+SD+PD)×100%。疾病控制率(disease control rate，DCR)=(CR+PR+SD)/(CR+PR+SD+PD)×100%。② 不良反應評定標準：不良反應的評價是根據(jù)美國國家癌癥研究所常見不良反應事件評價標準(CTCAE)4.0版，在每次治療前進行不良反應的記錄。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間比較選用χ2或Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1MDR1(G26677T/A)、CDA(A79C)、GSTP1(I105V)位點的基因型MDR1(G26677T/A)位點的基因型表現(xiàn)為GG、TT、TA、GA、GT、AA均見突變；CDA(A79C)位點基因型表現(xiàn)為CC、AA、AC，均見突變；GSTP1(I105V)位點的基因型表現(xiàn)為AA、AG、GG均見突變；本研究納入MDR1(G26677T/A)、CDA(A79C)、GSTP1(I105V)3個基因，各個基因型測序代表見表1。對MDR1(G26677T/A)、CDA(A79C)、GSTP1(I105V)3個基因的SNP位點進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，結果顯示3個多態(tài)性位點的基因型對應P均>0.05，說明該樣本分布均符合Hardy-Weinberg平衡，從而驗證該樣本人群的基因型頻率符合遺傳平衡法則，具有穩(wěn)定性。

2.2 46例宮頸癌患者的化療方案通過測序法對實驗組23例患者進行基因多態(tài)性檢測，實驗組編號C1-C23，而對照組統(tǒng)一選用紫杉醇聯(lián)合順鉑化療，對照組編號D1-D23，實驗組相關化療方案見表2所示。

表2 實驗組化療方案

續(xù)表2

編號基因位點基因型體外藥物敏感性化療方案C16MDR1(G26677T/A)GG紫杉醇↓順鉑+吉西他濱GSTP1 (Ile105Val A/G)AG順鉑↑CDA(A79C)AA吉西他濱↑C17MDR1(G26677T/A)GG紫杉醇↓吉西他濱GSTP1 (Ile105Val A/G)AA順鉑↓CDA(A79C)AA吉西他濱↑C18MDR1(G26677T/A)GT紫杉醇↑紫杉醇+吉西他濱GSTP1 (Ile105Val A/G)AA順鉑↓CDA(A79C)AA吉西他濱↑*C19MDR1(G26677T/A)TA紫杉醇↑*紫杉醇+順鉑GSTP1 (Ile105Val A/G)AG順鉑↑CDA(A79C)AC吉西他濱↑C20MDR1(G26677T/A)GT紫杉醇↑紫杉醇+吉西他濱GSTP1 (Ile105Val A/G)AA順鉑↓CDA(A79C)AC吉西他濱↑C21MDR1(G26677T/A)TA紫杉醇↑紫杉醇+吉西他濱GSTP1 (Ile105Val A/G)AA順鉑↓CDA(A79C)AA吉西他濱↑C22MDR1(G26677T/A)AG紫杉醇↑紫杉醇+吉西他濱GSTP1 (Ile105Val A/G)AA順鉑↓CDA(A79C)AA吉西他濱↑*C23MDR1(G26677T/A)GT紫杉醇↑*紫杉醇+順鉑GSTP1 (Ile105Val A/G)AG順鉑↑CDA(A79C)AC吉西他濱↑

↑：表示基因檢測化療藥物敏感性高；↓：表示基因檢測化療藥物敏感性低；*：表示三種化療藥物敏感性都高選擇紫杉醇+順鉑進行化療

2.3MDR1(G2677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)SNP位點的基因型在宮頸癌中的分布MDR1(G2677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)SNP位點的基因型在宮頸癌中分布情況見表3。MDR1(G2677T/A)的TT、TA、GG、GA、GT基因型頻率分別為4.35%、13.04%、17.39%、8.70%、56.52%，其中藥物敏感組內TT、TA、GA、GT基因型頻率分別為4.35%、13.04%、8.70%、56.52%，不敏感組內GG基因型頻率分別為17.39%；GSTP1(Ile105Val A/G)的AA、AG基因型頻率分別為69.57%、30.43%，其中藥物敏感組內AG基因型頻率為34.78%，不敏感組AA基因型頻率為65.22%；CDA(A79C)的AA、AC、CC基因型頻率分別為69.57%、26.09%、4.35%，其中藥物敏感組內AA、AC基因型頻率分別為69.57%、26.09%，不敏感組CC基因型頻率為4.35%。

2.4MDR1(G2677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)基因多態(tài)性與宮頸癌患者化療敏感性的關系從23例宮頸癌患者經(jīng)基因檢測后對紫杉醇敏感者19(82.61%)例，不敏感者4(17.39%)例。其中MDR1(G2677T/A)多態(tài)的TT、TA、GG、GA、GT基因頻率分布在化療敏感組與化療不敏感組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。23例宮頸癌患者經(jīng)基因檢測后對順鉑敏感者8(34.78%)例，不敏感者15(65.22%)例。其中GSTP1(Ile105Val A/G)多態(tài)的AA、AG基因頻率分布在化療敏感組與化療不敏感組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。23例宮頸癌患者經(jīng)基因檢測后對吉西他濱敏感者22(95.65%)例，不敏感者1(4.35%)例。其中CDA(A79C)多態(tài)的AA、AC、CC基因頻率分布在化療敏感組與化療不敏感組，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表3 MDR1(G2677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)SNP位點的基因型在宮頸癌中的分布情況

表4 MDR1(G2677T/A)、GSTP1(I105V)、CDA(A79C)基因多態(tài)性與宮頸癌患者化療敏感性關系

2.5 宮頸癌實驗組與對照組近期療效對比通過近期隨訪21 d為1個化療周期，連續(xù)完成6個周期。將實驗組和對照組療效進行對比，發(fā)現(xiàn)實驗組客觀緩解率為95.65%，對照組客觀緩解率為73.91%，實驗組近期療效明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5，而兩組患者年齡、病理類型、臨床分期比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表5 兩組宮頸癌患者近期療效比較[n(%)]

2.6 不良反應實驗組發(fā)生Ⅰ～Ⅱ度骨髓抑制9例(39.13%)，Ⅲ度骨髓抑制12例(52.17%)，Ⅳ度骨髓抑制2例(8.69%)。23例發(fā)生Ⅰ～Ⅱ度胃腸道反應(100%)。20例發(fā)生0～Ⅰ度肝功能異常(86.95%)，3例(13.04%)發(fā)生Ⅱ～Ⅲ度肝功能異常。22例(95.65%)發(fā)生0～Ⅰ度腎功能異常，1例(4.34%)發(fā)生Ⅱ度腎功能異常。對照組發(fā)生Ⅰ～Ⅱ度骨髓抑制14例(60.86%)，Ⅲ度骨髓抑制7例(30.43%)，Ⅳ度骨髓抑制2例(8.69%)。22例(95.65%)發(fā)生Ⅰ～Ⅱ度胃腸道反應。22例(95.65%)發(fā)生0～Ⅰ度肝功能異常，1例(4.34%)發(fā)生Ⅱ～Ⅲ度肝功能異常。22例(95.65%)發(fā)生0～Ⅰ 度腎功能異常，1例(4.34%)發(fā)生Ⅱ 度腎功能異常。兩組不良反應發(fā)生率相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高，且診斷時往往處于中晚期[1]。隨著放療技術的提高，單純放療對宮頸癌治療療效似乎達到一個瓶頸[6]。這可能與腫瘤體積較大，放射野與放射劑量的局限性有關?；熆蓪Ψ暖煯a生協(xié)同作用，增強放射敏感性，減少局部復發(fā)及遠處轉移的風險。目前單獨或聯(lián)合使用順鉑的同步放化療方案是目前中晚期宮頸癌的標準治療。但最佳治療方法仍存在很多爭議和不確定性[7]。與藥物代謝、轉運相關的遺傳變異是導致個體間化療反應差異的原因之一。在臨床實踐中進行相關基因檢測，為個體患者提供基于基因型的藥物和劑量處方，可使藥物治療變得更有效或更安全[8]。中晚期宮頸癌常見的化療藥物包括紫杉醇、吉西他濱、順鉑等。相關基因檢測包括MDR1(G2677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)。因紫杉醇聯(lián)合順鉑是目前短期療效最佳且毒副反應偏小的化療方案[9]，故作為對照組化療方案。

紫杉醇是ABC轉運蛋白(也稱為P-糖蛋白)的底物。P-糖蛋白通過主動泵出藥物，使細胞內藥物濃度減低，影響療效。其表達和功能異常也被普遍認為是腫瘤細胞耐藥的機制之一。P-糖蛋白由ACBC1(MDR1)基因編碼，已報道MDR1基因有50多個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，其中G2677T/A SNP(rs2032582)可能與P-糖蛋白表達和功能有關。G2677T/A位點有三種單核苷酸多態(tài)性(SNP)：G/T/A。相關研究[10-11]發(fā)現(xiàn)G/G型可能為一保護性基因型，接受化療的G/G(野生型)患者局控率和遠期生存率均差于變異型。在本研究中，被檢測為G/G型的患者不采用紫杉醇化療。

谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)是鉑類藥物的解毒途徑之一。GSTP1位于5號外顯子105位密碼子A→G轉換，導致異亮氨酸Ile替換為纈氨酸Val，可影響酶的活性。通過薈萃分析GSTP1多態(tài)性與鉑類治療療效與毒性的關系，結果顯示與A/A型患者相比，變異型患者有可能具有更好的有效率，但毒性更高。目前已證實GSTP1多態(tài)性可作為晚期NSCLC亞洲患者接受鉑類治療中的療效、毒性、TTP和OS的預測指標[12]。在胃癌及結直腸的薈萃分析中亦顯示GSTP1多態(tài)性與化療反應率相關。在本研究中，被檢測為A/A型的患者不采用順鉑化療。

胞嘧啶核苷脫氨酶CDA可將絕大多數(shù)吉西他濱不可逆解毒為無活性代謝物雙氟脫氧尿苷dFdU。CDA(A79C)核酸多態(tài)性可改變酶的活性，影響吉西他濱的有效濃度。Tibald et al[13]發(fā)現(xiàn)在接受吉西他濱化療的患者中，攜帶A/A型和 A/C型的患者與C/C型患者相比具有更長的TTP和OS，差異具有統(tǒng)計學意義。故認為C/C型患者不能從吉西他濱化療中受益。

本研究通過檢測中晚期宮頸癌患者MDR1(G26677T/A)、GSTP1(Ile105Val A/G)、CDA(A79C)基因的表達情況，選取敏感化療方案進行適配化療，近期療效顯示進行基因檢測組療效優(yōu)于不進行基因檢測組，預示基因檢測可為中晚期宮頸癌患者的化療方案進行指導，增加中晚期宮頸癌的局部控制率、減少遠處轉移的風險。但因研究樣本量較少，隨訪時間較短。故仍需擴大樣本量、擴大基因檢測范圍、延長隨訪時間進一步指導臨床。