張小俠，張美玲，楊明珍

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP) 是以血小板(platelet, PLT)減少、巨核細(xì)胞增加且成熟障礙、皮膚黏膜出血為特征的自身免疫性疾病[1-2]。既往研究[3]表明ITP主要發(fā)病機(jī)制是PLT特異性自身抗體介導(dǎo)的PLT破壞，常見(jiàn)類型是抗血小板膜糖蛋白(glycoprotein,GP)IIb/IIIa和抗GPIb抗體。深入研究[4-5]發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)異常也參與ITP發(fā)病機(jī)制。研究[6]表明清除小鼠體內(nèi)CD8+CD28-Treg會(huì)加劇PLT降低，輸注富含CD8+CD28-Treg的CD8+T細(xì)胞可升高PLT，延緩小鼠ITP疾病進(jìn)展。但人ITP中CD8+CD28-Treg的表達(dá)變化和作用機(jī)制尚不清楚。激素是ITP治療一線用藥，效果顯著，但副作用大且部分患者無(wú)效。重組人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin, rhTPO)為ITP治療的二線用藥，療效已有研究[7]證實(shí)，但停藥后，PLT易回落，不能維持療效。該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)患者治療前后CD8+CD28-Treg及細(xì)胞因子的表達(dá)，分析CD8+CD28-Treg及細(xì)胞因子在ITP發(fā)病及臨床治療中的意義，檢測(cè)治療前PLT自身抗體的表達(dá)，分析抗體種類與臨床用藥療效的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2017年2月～2018年11月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門(mén)診和住院治療的初診ITP患者73例。其中男27例，女46例，年齡16～82歲，中位年齡47歲，超過(guò)40歲者25例，PLT計(jì)數(shù)≤10×109/L者41例，均符合ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)?；颊吲R床資料見(jiàn)表1。正常對(duì)照組30例，均為同時(shí)期健康體檢者，男12例，女18例，年齡22～68歲，中位年齡38歲。

1.2 療效判定標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[8]：① 完全反應(yīng)：治療后PLT≥100×109/L，無(wú)出血癥狀。② 有效：治療后 PLT>30×109/L，比基礎(chǔ)PLT計(jì)數(shù)增加至少2倍、無(wú)出血癥狀。③ 無(wú)效：治療后PLT≤30×109/L，PLT計(jì)數(shù)增加不到基礎(chǔ)值的2倍或有出血癥狀。

表1 ITP患者臨床資料[n(%)]

1.3 主要試劑與器材別藻藍(lán)蛋白抗體(APC)標(biāo)記的小鼠抗人CD28單克隆抗體(mAb) 、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的小鼠抗人CD8 mAb、藻紅蛋白-德州紅-X(ECD)標(biāo)記的小鼠抗人CD3 mAb、溶血?jiǎng)?、破膜劑、流式?xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD公司。Coul-terlh750型血細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)儀購(gòu)自美國(guó)Beckman公司。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor, TGF)-β1、白介素(interleukin, IL)-10和干擾素(interferon, IFN)-γ ELISA試劑盒購(gòu)于武漢ABclonal公司。ITP抗血小板抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自常州福隆生物有限公司。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1CD8+CD28-Treg檢測(cè) 采集ITP患者治療前、治療后及健康對(duì)照者外周肝素抗凝血6 ml。2 ml 2 500 r/min離心10 min，收集無(wú)溶血血清標(biāo)本，-80 ℃冰箱凍存，用于細(xì)胞因子檢測(cè)。50 μl抗凝血中加入抗人CD3-ECD、CD8-FITC、CD28-APC單克隆抗體各5 μl,避光孵育15 min,再加入紅細(xì)胞裂解液500 μl,振蕩后混勻,避光孵育10 min。1 500 r/min離心5 min,棄上清液，加入1 ml PBS后以1 500 r/min離心5 min，棄上清液，用800 μl PBS重懸浮后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4.2血小板特異性自身抗體檢測(cè)及血小板制備 采集標(biāo)本1 400 r/min離心5 min，分離富血小板血漿(platelet rich plasma, PRP)，取PRP，再5 400 r/min離心2 min，棄上清液，下層沉淀為PLT，PLT用800 μl血小板洗滌液洗滌3次，-20 ℃保存(時(shí)間：2周)；向PLT中加入110 μl裂解液震蕩混勻后室溫?fù)u床裂解30 min，5 400 r/min離心20 min；取上清液100 μl到另一EP管，加入已經(jīng)包被5種不同單抗的微球混合液50 μl，震蕩混勻，室溫避光孵育1 h；加入600 μl微球洗滌液，3 800 r/min離心20 min，輕輕吸取上清液，底部約留100 μl殘留液；再加入FITC標(biāo)記的羊抗人IgG多克隆抗體10 μl，震蕩混勻。室溫避光孵育30 min；加入600 μl微球洗滌液，3 800 r/min離心20 min，輕輕吸取上清液，底部約留100 μl殘留液，加入500 μl微球洗滌液，上機(jī)檢測(cè)；在使用前，按照本實(shí)驗(yàn)方法用3份正常人PLT作為陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以確定本實(shí)驗(yàn)室的臨界值。

1.4.3檢測(cè)細(xì)胞因子TGF-β1、IFN-γ和IL-10含量 采用ELISA法檢測(cè)，按有關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.4治療方法 激素組患者應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療，給予地塞米松40 mg/d，連用4 d，或甲潑尼龍1～2 mg/(kg·d)，至PLT達(dá)到(80～100)×109/L后改為潑尼松1 mg/(kg·d)口服。rhTPO組患者皮下注射rhTPO注射液，劑量300 U/(kg·d)，療程14 d。若未達(dá)14 d，當(dāng)PLT≥100×109/L，停止給藥。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組及ITP患者治療前后CD8+CD28-Treg及細(xì)胞因子的表達(dá)結(jié)果

2.1.1對(duì)照組與患者治療前CD8+CD28-Treg及細(xì)胞因子的表達(dá)結(jié)果比較 ITP患者治療前CD8+CD28-Treg低于正常對(duì)照組，細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1的表達(dá)低于正常對(duì)照組，IFN-γ的表達(dá)高于正常對(duì)照組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組及ITP患者治療前CD8+CD28- Treg及細(xì)胞因子的表達(dá)

與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.1.2有效組治療前后CD8+CD28-Treg及細(xì)胞因子的表達(dá)結(jié)果比較 激素及rhTPO治療后CD8+CD28-Treg的表達(dá)均較治療前上升，細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1的表達(dá)均較治療前增加，IFN-γ的表達(dá)均較治療前下降，治療前和治療后比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。CD8+CD28-Treg的流式表達(dá)圖例見(jiàn)圖1。

2.1.3無(wú)效組治療前后CD8+CD28-Treg及細(xì)胞因子的表達(dá)結(jié)果比較 激素及rhTPO治療后CD8+CD28-Treg、IFN-γ、IL-10、TGF-β1的表達(dá)和治療前相比均未出現(xiàn)明顯變化，治療前和治療后比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

2.2 ITP患者治療前CD8+CD28-Treg的表達(dá)對(duì)療效預(yù)測(cè)的意義根據(jù)有效組和無(wú)效組患者治療前所測(cè)CD8+CD28-Treg的值，繪制ROC曲線，分析CD8+CD28-Treg對(duì)臨床用藥療效的預(yù)測(cè)作用。激素組治療前CD8+CD28-Treg的臨界值為14.35，曲線下面積(area under curve, AUC)為0.74(P<0.05)，95%CI：0.575～0.904。此時(shí)預(yù)測(cè)激素療效的敏感性和特異性為66.7%和73.3%，27例治療有效者中，CD8+CD28-Treg小于14.35的有18例(66.7%)，15例無(wú)效者中大于14.35的有11例(73.3%)，見(jiàn)圖2。rhTPO組治療前CD8+CD28-Treg的臨界值為15.45，AUC為0.75(P<0.05), 95%CI：0.560～-0.940。此時(shí)預(yù)測(cè)rhTPO療效的敏感性和特異性為63.6%和88.9%。22例治療有效者中，CD8+CD28-Treg大于15.45的有14例(63.6%)，9例治療無(wú)效者中小于15.45的有8例(88.9%)，見(jiàn)圖3。上述結(jié)果提示CD8+CD28-Treg有可能作為患者療效預(yù)測(cè)的指標(biāo)之一。

2.3 血小板特異性抗體的表達(dá)結(jié)果激素組抗GPⅡb/Ⅲa抗體陽(yáng)性患者17例，有效10例，無(wú)效7例。GPⅡb/Ⅲa抗體陰性患者25例，有效17例，無(wú)效8例。兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( χ2=0.371,P>0.05)?？笹PIb抗體陽(yáng)性患者18例，有效8例，無(wú)效10例，抗GPIb抗體陰性患者24例，有效19例，無(wú)效5例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=5.401,P<0.05)。 rhTPO組抗GPⅡb/Ⅲa抗體陽(yáng)性患者11例，有效7例，無(wú)效4例，抗GPⅡb/Ⅲa抗體陰性患者20例，有效15例，無(wú)效5例，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？笹PIb抗體陽(yáng)性患者13例，有效7例，無(wú)效6例，抗GPIb抗體陰性患者18例，有效15例，無(wú)效3例，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5、6和圖4。

表3 激素及rhTPO有效組治療前后CD8+CD28- Treg及細(xì)胞因子的表達(dá)

與激素治療前比較：*P<0.05；與rhTPO治療前比較：#P<0.05

圖1 CD8+CD28-Treg流式細(xì)胞表達(dá)圖

組別nCD8+CD28- Treg(%)TGF-β1(pg/ml)IL-10(pg/ml)IFN-γ(pg/ml)激素組治療前1516.62±4.041 004.88±201.9514.04±2.2397.07±15.68激素組治療后1516.78±4.911 103.98±276.7713.03±2.0190.11 ±16.72rhTPO組治療前913.20±3.411 015.95±252.8511.93±2.5995.26±14.27rhTPO組治療后917.37±4.621 113.49±161.2313.64±2.5792.59±15.27

圖2 激素組治療前CD8+CD28- Treg的變化在ROC曲線中的表現(xiàn)

表5 激素組血小板特異性抗體表達(dá)類型和療效的關(guān)系(n)

與B組比較：*P<0.05

圖3 rhTPO組治療前CD8+CD28- Treg的變化在ROC曲線中的表現(xiàn)

表6 rhTPO組血小板特異性抗體表達(dá)類型和療效的關(guān)系(n)

3 討論

ITP是出血性疾病中最為常見(jiàn)的一種，約占出血性疾病的30%。ITP發(fā)病機(jī)制文獻(xiàn)報(bào)道眾多，涉及多個(gè)方面，其可能與多種病理因素引起的體液免疫和細(xì)胞免疫異常有關(guān)。課題組前期研究[9]表明ITP患者外周血中存在CD8+T細(xì)胞亞群及樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的改變。且在部分糖皮質(zhì)激素?zé)o效的患者中比例較對(duì)照組下降，提示CD8+T細(xì)胞中除具有免疫殺傷作用外，應(yīng)還具有類似Treg的功能，CD8+CD28-Treg是CD8+T細(xì)胞的重要組成部分，通過(guò)細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CD8+CD28-Treg的受體多樣性降低，端粒變短，抗原誘導(dǎo)增殖的能力減弱，分化能力降低，細(xì)胞毒性減弱或消失[10]。目前認(rèn)為CD8+CD28-Treg主要通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞之間直接接觸或者分泌相關(guān)細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β1、IFN-γ等發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能[11]。有研究[12]報(bào)道該類細(xì)胞在炎癥、腫瘤、自身免疫病等發(fā)病過(guò)程中起到了重要的作用。

圖4 流式微球檢測(cè)結(jié)果圖

本研究顯示ITP患者治療前CD8+CD28-Treg及細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1的表達(dá)低于正常對(duì)照組，IFN-γ的表達(dá)高于正常對(duì)照組,說(shuō)明在ITP患者中存在CD8+CD28-Treg及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)異常。激素和rhTPO治療后有效患者CD8+CD28-Tregs、IL-10、TGF-β1的表達(dá)明顯增加，INF-γ的表達(dá)降低。治療后無(wú)效患者改變不大，說(shuō)明激素和rhTPO可能通過(guò)調(diào)節(jié)CD8+CD28-Treg及細(xì)胞因子在ITP患者體內(nèi)的表達(dá)發(fā)揮療效。通過(guò)繪制治療前CD8+CD28-Treg與療效的ROC曲線分析得知，通過(guò)檢測(cè)治療前 CD8+CD28-Treg的比例可以預(yù)測(cè)激素及rhTPO的療效，為臨床治療提供參考作用。

有研究[13]顯示，約60% ITP患者外周血中能檢測(cè)出血小板特異性自身抗體，其中最重要的組成部分是抗GPⅡb/GPⅢa抗體和抗GPIb抗體。兩種抗體也可同時(shí)存在于部分患者。本實(shí)驗(yàn)顯示，抗GPIb抗體陽(yáng)性患者使用激素治療的療效不佳。而抗GPⅡb/Ⅲa抗體是否陽(yáng)性，激素治療效果差異不大，分析原因可能是兩種抗體導(dǎo)致PLT減少的機(jī)制不同。GPⅡb/GPⅢa屬于整合素家族，具有聯(lián)接PLT與纖維蛋白原的功能，與PLT特異性GPⅡb/GPⅢa抗體結(jié)合后形成抗原-抗體復(fù)合物，通過(guò)Fc受體單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)識(shí)別抗原-抗體復(fù)合物破壞血小板。GPIb屬于富含亮氨酸家族蛋白，可結(jié)合血管假性血友病因子介導(dǎo)血小板黏附，與抗體結(jié)合之后會(huì)通過(guò)非Fc受體依賴途徑引起血小板破壞[13-14]。建議對(duì)抗GPIb陽(yáng)性患者避免應(yīng)用激素等以網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的Fc受體為主要作用靶點(diǎn)的治療方法。

綜上所述，ITP患者存在CD8+CD28-Treg及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)異常，激素和rhTPO可能通過(guò)調(diào)節(jié)CD8+CD28-Treg及其相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)發(fā)揮療效。CD8+CD28-Treg有可能作為激素及rhTPO的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)之一，同時(shí)對(duì)抗GPIb抗體陽(yáng)性的ITP患者采取非激素治療，可能取得更好的治療效果。后續(xù)可以納入以丙球、利妥昔單抗等用藥作為治療方案的ITP患者作為實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)一步探究CD8+CD28-Treg及PLT特異性抗體在其臨床治療中的意義，為臨床的個(gè)體化治療提供參考依據(jù)。