王海霞，陳先俠，盧曉倩，季燕雯，孫嘉敏，江梅花，劉 敏，孔令霞，汪陶榮，陳曉宇

隨著“二孩”政策的實(shí)施，瘢痕子宮再次妊娠的孕婦明顯增加，胎盤(pán)植入的發(fā)生率呈上升趨勢(shì)。在胎盤(pán)植入患者剖宮產(chǎn)術(shù)中，臨床目前常常采用腹主動(dòng)脈球囊阻斷術(shù)，即通過(guò)阻斷腹主動(dòng)脈減少出血，但阻斷腹主動(dòng)脈易造成子宮缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/RI)，子宮平滑肌收縮乏力，易引起孕婦產(chǎn)后出血的發(fā)生[1]。I/RI的程度與缺血時(shí)間有關(guān)[2]，如何在有效的阻斷時(shí)間內(nèi)盡量減少并發(fā)癥的發(fā)生亟待解決。同時(shí)，再灌注子宮損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但研究[3]表明，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)和核因子-κB/p65(nuclear factor-κB/p65，NF-κB/p65)與I/RI關(guān)系密切。為進(jìn)一步明確腹主動(dòng)脈阻斷后再灌注導(dǎo)致子宮平滑肌損傷，收縮乏力，該研究通過(guò)阻斷家兔腎下腹主動(dòng)脈建立I/RI動(dòng)物模型，觀察血清炎性細(xì)胞因子改變以及不同缺血/再灌注時(shí)間點(diǎn)家兔子宮組織TLR4和NF-κB/ p65表達(dá)情況，探討腹主動(dòng)脈阻斷的安全時(shí)效和部分機(jī)制，為臨床安全應(yīng)用腹主動(dòng)脈阻斷術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料① 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級(jí)新西蘭白兔40只，雌性，體質(zhì)量(2.07±0.31) kg，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20 ℃,濕度40%，由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。② 試劑盒：兔和人白介素-6(interleukin-6, IL-6)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α) ELISA試劑盒購(gòu)自上海碧云天試劑公司；羊抗兔TLR4、NF-κB、β-actin一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組及模型制備 將雌兔隨機(jī)分為4組，分別為假手術(shù)組(A)、缺血20 min組(B)、缺血40 min組(C)、缺血60 min組(D)，每組10只兔子，兔子用20%烏拉坦(5 ml/kg)麻醉，左側(cè)臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，右下腹部切口，暴露腹主動(dòng)脈，在髂總動(dòng)脈分叉上方1.0 cm用動(dòng)脈夾阻斷腹主動(dòng)脈，至阻斷平面以下動(dòng)脈搏動(dòng)消失為準(zhǔn)，阻斷相應(yīng)時(shí)間后去除動(dòng)脈夾恢復(fù)血流。假手術(shù)組(A)：手術(shù)步驟同缺血組，暴露腹主動(dòng)脈，但不作腹主動(dòng)脈阻斷。

1.2.2標(biāo)本采集 B、C、D 3組分別在術(shù)前(T0)、再灌注10 min(T1)、再灌注40 min(T2)和再灌注90 min(T3)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)抽取2 ml頸靜脈血，對(duì)照組在與D組相同時(shí)間點(diǎn)抽血，以2 000 r/min離心后取血清，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。再灌?0 min后，處死家兔，取部分子宮組織，10%甲醛固定48 h后脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察子宮結(jié)構(gòu)改變。另取部分子宮組織樣本，轉(zhuǎn)移至液氮中冷藏備用。

1.2.3ELISA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-6濃度 操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，于波長(zhǎng)450 nm檢測(cè)樣本光密度(optical density, OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)液曲線，從曲線中得出各組血清中TNF-α和IL-6濃度。

1.2.4免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)子宮TLR4、NF-κB/p65表達(dá)和結(jié)果數(shù)量判定 操作步驟按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。組織常規(guī)脫水、石蠟包埋，厚4 μm連續(xù)切片，烤片、脫蠟、微波抗原修復(fù)，山羊血清封閉，滴加一抗(1 ∶200稀釋)50 μl，4 ℃孵育過(guò)夜，沖洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗(1 ∶200稀釋)50 μl，滴加DAB工作液顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。利用Nikon 4500顯微鏡攝片，TLR4、NF-κB表達(dá)陽(yáng)性染色結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)或胞核染色成棕黃色。

1.2.5Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá) 按照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)，取凍存的子宮組織，組織勻漿后提取和測(cè)定組織蛋白，調(diào)整上樣蛋白質(zhì)濃度，行SDS-PAGE凝膠電泳，分離1.5 h后，200 mA恒流下2 h，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，PBST(10 min×3次)洗去封閉液，羊抗TLR4、NF-κB/p65和β-actin多克隆抗體(稀釋度均為1 ∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，搖床上PBST(10 min×3次)洗滌后，將PVDF膜放入通用型二抗中，在搖床上37 ℃溫箱中孵育0.5 h。ECL顯色，Image J軟件半定量進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，比較子宮組織TLR4、NF-κB/p65條帶與β-actin的OD值，進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 血清TNF-α、IL-6濃度指標(biāo)重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果TNF-α的組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10 906.626，P<0.001)，各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9 260.965，P<0.001)，組間與時(shí)間點(diǎn)之間存在交互效應(yīng)(F=4 241.84，P<0.001)。IL-6的組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=175 188.5，P<0.001)，各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=73 139.39，P<0.001)，組間與時(shí)間點(diǎn)之間存在交互效應(yīng)(F=40 778.52，P<0.001),見(jiàn)表1。

通過(guò)各組TNF-α、IL-6兩兩比較，各組在T0時(shí)，血清TNF-α、IL-6濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D組在T1、T2、T3時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α、IL-6濃度均高于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組在T1時(shí)點(diǎn)IL-6濃度高于A組和B組，在T2和T3時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-6濃度均高于A組和B組，但明顯低于D組(P<0.05)；A組和B組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，C組和D組TNF-α、IL-6表達(dá)呈明顯上升趨勢(shì)，在T2和T3時(shí)刻達(dá)到持平。

表1 TNF-α、IL-6指標(biāo)重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果

表2 4組血清細(xì)胞因子濃度比較

與A組比較：*P<0.05；與B組比較：#P<0.05；與C組比較：△P<0.05

2.2 子宮內(nèi)膜光鏡下變化D組子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞及間質(zhì)明顯水腫，滲出增加，肌纖維排列紊亂，部分溶解，可見(jiàn)較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)和充血；C組子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞及間質(zhì)腫脹，肌纖維排列尚整齊，部分細(xì)胞及間質(zhì)可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，明顯輕于D組；A組和B組子宮內(nèi)膜組織細(xì)胞及間質(zhì)、肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)膜子宮腺體幾乎無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

2.3 免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)組織TLR4、NF-κB/p65蛋白的表達(dá)免疫組織化學(xué)SP法結(jié)果顯示，相對(duì)于未阻斷血流的A組，TLR4陽(yáng)性染色結(jié)果在B、C、D 3組表達(dá)較高，且隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，TLR4陽(yáng)性染色表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)，陽(yáng)性表達(dá)由子宮腺間質(zhì)逐漸向肌間結(jié)締組織彌散，見(jiàn)圖2；NF-κB/p65陽(yáng)性染色結(jié)果與TLR4相類(lèi)似，相對(duì)于未阻斷血流的A組，NF-κB/p65陽(yáng)性染色表達(dá)在B、C、D 3組中隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)，而對(duì)照A組表達(dá)明顯降低。見(jiàn)圖3。

2.4 Western blot檢測(cè)子宮肌組織中TLR4、NF-κB/p65蛋白表達(dá)情況Western blot結(jié)果顯示，正常對(duì)照組子宮組織中TLR4、NF-κB/p65蛋白低表達(dá)，而腹主動(dòng)脈阻斷后的B、C、D 3組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)升高，且隨著阻斷時(shí)間的延長(zhǎng)，C組、D組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)較正常對(duì)照明顯升高；應(yīng)用Image J軟件比較灰度比值，C組和D組子宮肌組織中TLR4/β-actin、NF-κB/β-actin較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.037，P<0.05)，見(jiàn)圖4。

3 討論

剖宮產(chǎn)術(shù)后，再次妊娠孕婦中胎盤(pán)植入患者明顯增多，為減少剖宮產(chǎn)術(shù)中出血，常常需要阻斷腹主動(dòng)脈，但阻斷血流時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，復(fù)灌時(shí)會(huì)發(fā)生平滑肌I/RI[1]。同時(shí)，在缺血/再灌注過(guò)程中，炎癥反應(yīng)被證實(shí)在多種器官或組織的損傷中發(fā)揮重要作用[2]。在缺血階段，炎癥細(xì)胞向肌肉組織及間質(zhì)浸潤(rùn)以及產(chǎn)生氧化應(yīng)激，加劇缺血損傷，導(dǎo)致子宮平滑肌收縮功能障礙。在剖宮產(chǎn)術(shù)應(yīng)用腹主動(dòng)脈阻斷術(shù)中，部分患者再次恢復(fù)血流后出現(xiàn)子宮癱軟，收縮不佳，子宮血管竇不能閉合導(dǎo)致大量出血，嚴(yán)重威脅患者的生命安全。目前對(duì)于腹主動(dòng)脈阻斷的安全時(shí)限的探討都以臨床表現(xiàn)為依據(jù)，無(wú)客觀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究通過(guò)不同時(shí)間阻斷家兔腹主動(dòng)脈，觀察子宮內(nèi)膜和平滑肌的損傷程度，結(jié)果表明，在20 min內(nèi)的腹主動(dòng)脈阻斷中，子宮內(nèi)膜間質(zhì)水腫和炎細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，是較為理想的阻斷腹主動(dòng)脈安全時(shí)間點(diǎn)。

圖1 4組兔子宮內(nèi)膜光鏡表現(xiàn) HE×100

圖2 4組兔子宮組織TLR4陽(yáng)性表達(dá)情況 SP×200

圖3 4組兔子宮組織NF-κB/p65陽(yáng)性表達(dá)情況 SP×200

圖4 子宮組織中TLR4、NF-κB/p65蛋白表達(dá)情況

炎性反應(yīng)在I/RI中越來(lái)越受到重視，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)與炎癥反應(yīng)有關(guān)，其中TLR4是TLRs家族的重要亞型之一，近年研究[4]顯示I/RI與TLR4信號(hào)通路的激活有關(guān)，TLR4活化后可以上調(diào)TNF-α、IL-6等炎性因子的表達(dá)。TNF-α主要由單核-巨噬細(xì)胞分泌，激活血管內(nèi)的炎性細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-6等炎性因子的釋放，嚴(yán)重缺血時(shí)可誘使多形核白細(xì)胞堵塞小毛細(xì)血管，加重組織缺血損傷[5]。本研究中，T0時(shí)，各組血清TNF-α、IL-6濃度處于較低水平；腹主動(dòng)脈阻斷后B組在T1、T2、T33個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α、IL-6濃度升高不明顯，但隨著腹主動(dòng)脈阻斷時(shí)間延長(zhǎng)，C組和D組在再灌注后血清TNF-α、IL-6濃度均升高，炎癥反應(yīng)加重，且D組再灌注損傷最明顯，其在再灌注后各時(shí)間點(diǎn)TNF-α、IL-6濃度均較其他3組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

NF-κB是TLR下游信號(hào)通路居中心地位的轉(zhuǎn)錄因子，抑制TLR下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的NF-κB可以減輕炎癥反應(yīng)[6]。NF-κB能與多種基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的κB 位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合并促使基因轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程中多種細(xì)胞因子和細(xì)胞黏附因子表達(dá)，在感染性疾病和自身免疫性疾病的發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用[7]。在哺乳類(lèi)細(xì)胞中有5種NF-κB家族成員，其中p65是NF-κB家族中的一個(gè)重要亞基，在炎癥反應(yīng)中的作用明確[8]。研究[9]表明，子宮I/RI可導(dǎo)致能量代謝障礙，引起氧化應(yīng)激，促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)了各組雌兔血清TNF-α、IL-6和子宮平滑肌TLR4、NF-κB/p65的表達(dá)情況，結(jié)果表明，對(duì)照組各時(shí)點(diǎn)血清及子宮平滑肌組織中各指標(biāo)含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示缺血/再灌注造成了子宮平滑肌損傷。有研究[10]表明，缺血/再灌注的大鼠子宮存在氧自由基和炎癥因子大量產(chǎn)生的病理狀態(tài)，推測(cè)子宮缺血導(dǎo)致能量代謝障礙，局部細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)激活導(dǎo)致自由基產(chǎn)生，再灌注后，子宮釋放大量自由基和炎癥因子導(dǎo)致子宮肌纖維損傷。通過(guò)減輕I/RI過(guò)程中的炎癥反應(yīng)可能起到保護(hù)子宮I/RI的作用，缺血的時(shí)間直接影響再灌注損傷的嚴(yán)重程度。本研究顯示，缺血再灌注后各時(shí)點(diǎn)血清TNF-α、IL-6含量均升高，隨著缺血時(shí)間以及再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，TNF-α、IL-6表達(dá)呈上升趨勢(shì)。B組血清中TNF-α及IL-6濃度隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)都略有升高，但與缺血前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且B組子宮平滑肌中TLR4、NF-κB/p65表達(dá)較少，因此可以推斷腹主動(dòng)脈阻斷20 min內(nèi)是安全的。C組在再灌注后血清TNF-α及IL-6濃度明顯升高，但升高程度均小于D組，在光鏡下，C組子宮平滑肌損傷較輕，呈現(xiàn)可逆性損傷，因此腹主動(dòng)脈阻斷40 min造成的I/RI較輕。

綜上所述，本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證阻斷20 min是阻斷兔腹主動(dòng)脈的安全時(shí)效，在必要情況下可延長(zhǎng)至40 min，對(duì)機(jī)體損傷較小。此安全時(shí)效可為臨床使用腹主動(dòng)脈球囊阻斷技術(shù)提供參考依據(jù)，但本研究?jī)H僅檢測(cè)部分器官缺血再灌注損傷情況，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多臟器以更全面地驗(yàn)證其安全性。