高 敏，劉文博，趙奇紅，王 華，顧康生

胃癌(gastric cancer,GC)的發(fā)病率、死亡率在我國(guó)高居第二位[1]。GC患者早期缺乏特異性癥狀，往往明確診斷時(shí)已處于進(jìn)展期，其5年生存率不足30%[2]。所以，GC的早期診斷尤為重要，目前臨床常用于GC輔助診療的腫瘤標(biāo)志物[癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、糖類抗原CA199(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)]等特異性、敏感性不強(qiáng)[3]，因此,迫切需要尋找新的腫瘤標(biāo)志物,用于GC的早期診斷及預(yù)后評(píng)估。近年來(lái)，隨著對(duì)非編碼RNA的研究深入，微小RNA(microRNA，miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)在GC中的作用逐漸被揭曉[4-5]。其中，circRNA以其普遍性、穩(wěn)定性、高度保守性以及組織特異性等優(yōu)勢(shì)[6]，有望成為理想的腫瘤早期診斷的分子標(biāo)志物。課題組前期通過(guò)circRNA芯片測(cè)序發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0010985在GC耐藥患者血漿中高表達(dá)，提示其可能參與GC的化療耐藥，而其對(duì)GC細(xì)胞的生物學(xué)功能及其臨床意義尚不清楚(待發(fā)表)。該研究主要探討hsa_circ_0010985在GC細(xì)胞和組織中的表達(dá)以及對(duì)GC細(xì)胞增殖和凋亡的影響和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本收集2017年3月～2017年7月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科共43例GC組織標(biāo)本及距腫瘤邊緣>5 cm處癌旁正常組織標(biāo)本，離體后立即液氮灌運(yùn)輸并長(zhǎng)期保存至-196 ℃液氮中備用。

1.2 主要試劑人GC細(xì)胞系、人正常胃黏膜細(xì)胞均為安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RNA提取試劑TRIzol、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)方法(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購(gòu)自合肥白鯊生物科技有限公司；AnnexinV-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；siRNA設(shè)計(jì)與合成由上海吉瑪制藥技術(shù)公司完成；引物設(shè)計(jì)及合成由上海生物工程有限公司完成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)正常胃黏膜細(xì)胞株GES-1和GC中分化細(xì)胞株SGC7901和AGS以及低分化細(xì)胞株BGC823均使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在含5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，常規(guī)2～3 d更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantificational real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)用TRIzol提取細(xì)胞和組織中的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過(guò)SYBR Green熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，GAPDH作為內(nèi)參基因，引物序列為：hsa_circ_0010985 F：5′-CT GATGGGCACCTCTGTTGG-3′，R: 5′-GCTCATAGTCT GCCAATGGAAC-3′;GAPDH F:5′-AATGAAGGGGT CATTGATGG-3′，R：5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCA A-3′；反應(yīng)條件為:95 ℃、5 s，55 ℃、30 s，72 ℃、20 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)清洗、消化、重懸后，在轉(zhuǎn)染前1 d接種于6孔板內(nèi)，接種密度約為60%～70%，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。第2天，將10 μl siRNA溶于250 μl Opti-mem減血清培養(yǎng)基，輕輕混勻后，室溫孵育5 min,將8 μl lipofectamine 2000TM溶于另一250 μl Opti-mem減血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻后，室溫孵育5 min，然后將兩管溶液混合后，室溫靜置20 min后將其加入6孔板的相應(yīng)孔中，補(bǔ)足培養(yǎng)基至2 ml，6～8 h后根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)決定是否換液。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GC細(xì)胞增殖將實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照(negative control，si-NC )組、siRNA-hsa_circ_0010985-1(si-circ0010985-1)和siRNA-hsa_circ_0010985-2(si-circ0010985-2)組，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組分別接種于96孔板，每孔約為1 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后0、1、2、3 d分別加入10 μl CCK8繼續(xù)培養(yǎng)2 h后檢測(cè)450 nm處各孔的吸光度(optical density，OD)值。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)GC細(xì)胞凋亡率將細(xì)胞均勻接種于6孔板，轉(zhuǎn)染48 h后用不含EDTA的胰酶消化，離心后收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入400 μl 1×Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，濃度約為1×106個(gè)/ml，將其移至流式管中，加入5 μl Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后于4 ℃避光條件孵育15 min后，再加入10 μl PI染色液輕輕混勻后4 ℃避光條件孵育5 min，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0010985在GC細(xì)胞及組織中的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，不同細(xì)胞組間hsa_circ_0010985表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.372，P=0.000)，hsa_circ_0010985在GC細(xì)胞中顯著高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。癌旁正常組織及GC組織比較，hsa_circ_0010985在GC組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.487,P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖1 hsa_circ_0010985在不同GC細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 hsa_circ_0010985在GC組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

2.2 GC組織中hsa_circ_0010985的表達(dá)與GC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系GC組織中hsa_circ_0010985的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、CEA、CA199、腫瘤位置之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 GC組織中hsa_circ_0010985的表達(dá)與GC診斷的相關(guān)性分析受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線下面積(area under curve，AUC)為0.631(95%CI：0.513～0.748，P<0.05)，特異度和靈敏度分別為0.814和0.419。見(jiàn)圖3。

表1 GC組織中hsa_circ_0010985的表達(dá)與GC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖3 hsa_circ_0010985 ROC曲線及AUC

2.4 siRNA轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)鑒于hsa_circ_0010985在低分化細(xì)胞株BGC-823中顯著高表達(dá)，故選擇該細(xì)胞株進(jìn)行小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染以敲低hsa_circ_0010985表達(dá)，研究其對(duì)GC細(xì)胞增殖與凋亡的影響。siRNA轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞48 h后，經(jīng)過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，不同組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=24.627，P=0.000)，其中與si-NC組比較，siRNA組可顯著降低細(xì)胞內(nèi)hsa_circ_0010985表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖4 qRT-PCR檢測(cè)hsa_circ_0010985在BGC823細(xì)胞中轉(zhuǎn)染后的差異表達(dá)

2.5 CCK8檢測(cè)敲低hsa_circ_0010985后對(duì)GC細(xì)胞增殖的影響CCK-8實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)si-NC、si-circ0010985-1和si-circ0010985-2組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與si-NC組比較，si-circ0010985-1和siRNA-circ0010985-2組細(xì)胞增殖能力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 CCK-8檢測(cè)敲低BGC823細(xì)胞中hsa_circ_0010985的表達(dá)后對(duì)GC細(xì)胞增殖的影響

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)敲低hsa_circ_0010985對(duì)GC細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)si-NC、si-circ0010985-1和si-circ0010985-2組的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，不同組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.594，P=0.006)，與si-NC組比較，si-circ0010985-1和si-circ0010985-2組的細(xì)胞凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖6。

圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)敲低hsa_circ_0010985表達(dá)后對(duì)GC細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

近年來(lái)，circRNA不斷地受到科學(xué)界的關(guān)注，因而越來(lái)越多的circRNA被發(fā)現(xiàn)，其生物學(xué)功能也被逐漸認(rèn)識(shí)[7-8]。circRNA是前體RNA(pre-mRNA)在形成mRNA過(guò)程中，通過(guò)反向剪接，并以共價(jià)鍵首尾連接形成，由于其特殊的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使得其不易被核酸外切酶降解，因而相較于miRNA和lncRNA更加穩(wěn)定，說(shuō)明其有望成為疾病診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物[9]。通常，circRNA在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)水平較低，但是隨著研究的不斷地深入，發(fā)現(xiàn)circRNA可以在特定的細(xì)胞或組織中異常表達(dá)，可以與miRNA結(jié)合影響轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，或是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，影響剪切等[10]。在腫瘤領(lǐng)域中，對(duì)于circRNA的研究主要集中在腫瘤診斷與預(yù)后評(píng)估，以及其與miRNA結(jié)合發(fā)揮分子海綿的作用機(jī)制等方面。Zhang et al[11]研究發(fā)現(xiàn)circRNA La相關(guān)蛋白4 (circular RNA La-associated protein 4, circLARP4)在GC組織中表達(dá)下調(diào)，并且通過(guò)海綿miR-424和上調(diào)大腫瘤抑制激酶1抑制GC細(xì)胞增殖和侵襲，表明circLARP4可能作為腫瘤抑制因子抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。此外，Chen et al[12]研究表明hsa_circ_0000190在GC組織和血漿中下調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期以及CA199水平顯著相關(guān)，并通過(guò)ROC曲線分析表明hsa_circ_0000190可能是一種用于GC診斷的新型非侵入性生物標(biāo)志物。亦有研究[13]報(bào)道，與正常組織及細(xì)胞相比，circ-0067934在肝癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，敲低circ-0067934顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡；在機(jī)制研究方面，發(fā)現(xiàn)circ-0067934通過(guò)調(diào)節(jié)miR-1324/卷曲蛋白-5(frizzled-5, FZD5)基因激活細(xì)胞外因子/b-連環(huán)蛋白(b-catenin)通路，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展,所以circ-0067934/miR-1324/FZD5/b-catenin信號(hào)軸有希望成為肝癌的治療干預(yù)靶點(diǎn)。由此可見(jiàn)，circRNA在惡性腫瘤中異常表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡等生物學(xué)過(guò)程，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后以及疾病診斷密切相關(guān)。目前為止，本課題所研究的hsa_circ_0010985的生物學(xué)功能及臨床意義在國(guó)內(nèi)外報(bào)導(dǎo)尚未被研究闡明，因而具有極大的探索意義。

hsa_circ_0010985是mRNA前體在形成SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合富含谷氨酸蛋白基因的剪接過(guò)程中，由1號(hào)染色體的3號(hào)外顯子通過(guò)反向剪接形成的長(zhǎng)度為465個(gè)核苷酸的環(huán)狀RNA分子。在本課題中，前期通過(guò)circRNA芯片發(fā)現(xiàn)其在GC化療耐藥患者血漿中高表達(dá)，可能參與其GC耐藥的發(fā)生發(fā)展，但是是否參與GC的發(fā)生發(fā)展以及是否具有臨床意義尚不清楚。本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了1株胃黏膜正常細(xì)胞和3株GC細(xì)胞，以及43例GC患者的癌組織及癌旁正常組織中has_circ_0010985的相對(duì)表達(dá)水平，表明has_circ_0010985在GC細(xì)胞和組織中均高表達(dá)，通過(guò)進(jìn)一步分析顯示hsa_circ_0010985與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定的相關(guān)性，而與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、CEA、CA199、腫瘤位置之間無(wú)相關(guān)性。接下來(lái)，通過(guò)siRNA干擾hsa_circ_0010985在GC細(xì)胞中的表達(dá)后通過(guò)CCK8及流式細(xì)胞儀分析其生物學(xué)功能，結(jié)果表明下調(diào)hsa_circ_0010985的表達(dá)可抑制GC細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

總之，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hsa_circ_0010985可能充當(dāng)促癌基因發(fā)揮作用，并且具有一定的臨床意義，將來(lái)有望成為GC診斷的分子標(biāo)志物。但是，hsa_circ_0010985究竟通過(guò)何種機(jī)制與途徑發(fā)揮促癌作用，還有待進(jìn)一步研究及闡明其作用機(jī)制。