徐前飛，劉亞蒙，周 震，田志祥，王麗紅，胡 艷，李 靜，劉曉穎，葛 健

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)的特點(diǎn)是白血病細(xì)胞浸潤(rùn)骨髓、異常增殖和分化受阻。有50%～75%的患者對(duì)誘導(dǎo)化療敏感而達(dá)到緩解，但大多數(shù)會(huì)復(fù)發(fā)，只有30%～40%的患者能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期生存[1]，白血病細(xì)胞不能完全被藥物殺滅可能與高水平的藥物外排泵、有效的DNA修復(fù)以及環(huán)境介導(dǎo)耐藥等有關(guān)[2]。腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間生物信息交換存在多種方式，主要通過(guò)縫隙連接、整合素蛋白、四硫蛋白、鈣粘素、細(xì)胞因子、胞外囊泡等介導(dǎo)[3-4]。最近研究[5]發(fā)現(xiàn)一種新的細(xì)胞間相互作用方式—隧道納米管(tunneling nanotubes，TNTs)或者叫膜納米管，這些長(zhǎng)管狀結(jié)構(gòu)主要由肌動(dòng)蛋白和微管、微絲組成，直徑在50～1 500 nm，長(zhǎng)度可以跨越幾十到數(shù)百微米，將不同細(xì)胞的質(zhì)膜和胞質(zhì)連接在一起，從而實(shí)現(xiàn)將不同細(xì)胞成分從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)細(xì)胞，完成生物信息的直接交換。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間TNTs能夠傳遞包括細(xì)胞器、病原體、膜結(jié)合蛋白等[6-9]多種物質(zhì)。該研究通過(guò)模擬骨髓微環(huán)境，建立體外共培養(yǎng)體系鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BM-MSCs)與急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1細(xì)胞間TNTs結(jié)構(gòu)，觀察TNTs中線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)及其對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響，并探索細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來(lái)源 骨髓均來(lái)自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，征得患者同意，所有實(shí)驗(yàn)者均簽署知情同意書(shū)，骨髓結(jié)果明確診斷非白血病及其他血液系統(tǒng)惡性疾病。THP-1細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑及儀器 纖連蛋白(北京索萊寶公司)；MitoTracker Red CMXRos(美國(guó)Invitrogen公司)；Transwell小室3 μm(美國(guó)Corning公司)；Latrunculin B(美國(guó)APExBIO公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(上海貝博公司)；共聚焦顯微鏡LEICA.APA_DMI6000_DIC(德國(guó)徠卡公司)；DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；Ficoll細(xì)胞分離液(天津TBD公司)；Actin-Tracker Green 、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天公司)；CD45-APC抗體(美國(guó)Biolegend公司)；山羊抗兔生物素二抗(北京中杉金橋有限公司)；KIF5B單克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2BM-MSCs的分離、培養(yǎng) 肝素化骨髓取50 U/ml肝素抗凝的骨髓5 ml，加入等體積PBS細(xì)胞吹打混勻，室溫1 500 r/min離心10 min，去掉脂肪層，用PBS重懸細(xì)胞，緩慢注入等體積的1.073 g/ml Percoll分離液，2 000 r/min離心20 min，吸取中間的單個(gè)核細(xì)胞層，PBS清洗2次，重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，將細(xì)胞按1×106/ml接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后首次換液，以后2～3 d換液1次。待原代細(xì)胞增殖至鋪滿(mǎn)瓶底時(shí)，在0.25%胰蛋白酶消化以后以1×104/cm2接種在培養(yǎng)瓶中，實(shí)驗(yàn)中所用的間充質(zhì)干細(xì)胞均為第3～5代。

1.2.3細(xì)胞爬片的制備 取干凈的蓋玻片清洗干凈，浸泡在硫酸重鉻酸鉀溶液48 h后取出，自來(lái)水沖洗干凈，雙蒸水沖洗3次，高壓滅菌備用。準(zhǔn)備濃度為10 μg/ml纖維連接蛋白浸泡的蓋玻片，于超凈臺(tái)中晾干后置于6孔板中；線粒體特異性探針MitoTracker Red CMXRos用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至250 nmol/L，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育BM-MSCs(THP-1)30 min，PBS洗3次，用含10%胎牛血清的DMEM(1640)培養(yǎng)24 h，BM-MSCs配制成5×104/ml細(xì)胞懸液接種到有蓋玻片的孔中，待貼壁后吸去培養(yǎng)基，用5%FBS的1640將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 THP-1細(xì)胞濃度調(diào)至1×106/ml加入到接種了BM-MSCs的孔中，共培養(yǎng)24 h。

1.2.4細(xì)胞爬片的染色與熒光成像 將細(xì)胞爬片從培養(yǎng)皿中取出，用PBS溶液洗滌3次，滴加4%甲醛溶液于細(xì)胞爬片上，劑量為覆蓋爬片為準(zhǔn)，室溫固定細(xì)胞10 min，PBS溶液洗滌3次，每次5 min；滴加稀釋度為1 ∶100的Actin Tracker Green(Ex 496 nm，Em 516 nm)溶液于爬片上，每片200 μl，室溫避光孵育40 min，PBS溶液洗滌同上；滴加200 μl DAPI(Ex 405 nm，Em 420 nm)于爬片上對(duì)細(xì)胞核復(fù)染，室溫避光約2 min，封片劑DAKO封片；MitoTracker Red CMXRos(Ex 579 nm，Em 599 nm)，于共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號(hào)分布并采集圖像。

1.2.5THP-1細(xì)胞凋亡的Annexin V/PI熒光標(biāo)記法檢測(cè) 將P3-P5代BM-MSCs以5×104/孔接種于24孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的THP-1細(xì)胞，用10%FBS的1640重懸，以細(xì)胞密度為1×106接種于相應(yīng)的孔中，共培養(yǎng)體系包括BM-MSCs與THP-1細(xì)胞直接共培養(yǎng)(SC組)、間隔Transwell透膜(物理阻斷TNTs)共培養(yǎng)(TC組)、直接共培養(yǎng)體系中加入細(xì)胞松弛素Latrunculin B(TNTs抑制劑)1.25 μmol/L(LC組)、無(wú)BM-MSCs而僅有培養(yǎng)液(MC組)四組，共培養(yǎng)5 d。SC、LC組用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)消化、收集細(xì)胞，離心棄上清液，PBS清洗兩次，用95 μl PBS重懸，加入CD45-APC抗體5 μl，避光孵20 min，離心棄上清液，再用400 μl Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞，先后加入Annexin V-FITC 5 μl、Propidium lodide10 μl，分別避光孵育15 min、5 min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用Flowjo 7.6軟件分析。

1.2.6Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 用100 nmol/L Rotenone(線粒體特異性抑制劑)處理BM-MSCs 24 h或48 h；各組細(xì)胞加入蛋白酶抑制劑和裂解液的混合物，在冰上裂解30 min，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠，80 V(濃縮膠)/120 V(分離膠)電壓對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，在100 V恒壓條件下轉(zhuǎn)移1.5 h。PVDF膜用TBST沖洗并浸入5%脫脂牛奶中封閉，震蕩1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，一抗(1 ∶5 000)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1 ∶2 500)室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯像。

2 結(jié)果

2.1 鑒定BM-MSCs和THP-1細(xì)胞之間TNTs共聚焦顯微鏡下觀察到BM-MSCs與THP-1細(xì)胞間有長(zhǎng)管狀結(jié)構(gòu)形成，用熒光染料Actin-Tracker Green特異性染色，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)這些長(zhǎng)管狀結(jié)構(gòu)表達(dá)細(xì)胞骨架蛋白F-actin，提示這些管狀結(jié)構(gòu)即為T(mén)NTs，見(jiàn)圖1。

圖1 共聚焦顯微鏡下BM-MSCs與THP-1細(xì)胞間形成TNTs ×400

A：F-actin；B：細(xì)胞核；C：疊加效果; 白色箭頭指的是細(xì)胞間TNTs結(jié)構(gòu)

2.2 觀察BM-MSCs和THP-1細(xì)胞間線粒體通過(guò)TNTs轉(zhuǎn)運(yùn)用Mitotracker Red CMXRos特異性標(biāo)記線粒體，實(shí)驗(yàn)分為兩組：BMSCs(MitoTracker)+THP-1、BMSCs+THP-1(MitoTracker)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下共培養(yǎng)24 h后制片，并用共聚焦顯微鏡觀察。在顯微鏡下觀察到被熒光標(biāo)記的BM-MSCs線粒體通過(guò)TNTs轉(zhuǎn)運(yùn)到THP-1細(xì)胞中，見(jiàn)圖2A；并未觀察到THP-1細(xì)胞線粒體通過(guò)TNTs向BM-MSCs轉(zhuǎn)運(yùn)，見(jiàn)圖 2B；說(shuō)明線粒體是從BM-MSCs向THP-1細(xì)胞單向轉(zhuǎn)運(yùn)的。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組THP-1細(xì)胞凋亡率THP-1細(xì)胞與BM-MSCs共培養(yǎng)5 d后各組凋亡率比較，SC組、LC組、TC組及MC組凋亡率分別為(7.45±2.62)%、(24.03±2.3%)%、(58.34±5.73)%、(61.37±2.78)%，SC組及LC組凋亡率較MC組明顯減低(P<0.01)，且LC組較SC組凋亡率增高(P<0.01)，提示直接共培養(yǎng)后THP-1細(xì)胞凋亡率減低；與SC組比較，加入TNTs抑制劑Latrunculin B(破壞部分TNTs結(jié)構(gòu)，阻礙線粒體傳遞)后THP-1細(xì)胞凋亡率有所增高，提示直接共培養(yǎng)后THP-1細(xì)胞凋亡率下降可能與TNTs形成有關(guān)；TC組凋亡率較SC組及LC組明顯增高(P<0.01)，TC組與MC組凋亡率無(wú)差異(P>0.05)；Transwell透膜物理阻斷TNTs后(TC組)THP-1細(xì)胞凋亡率增高，而與THP-1細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)凋亡率無(wú)明顯差異，進(jìn)一步提示THP-1細(xì)胞凋亡率下降可能是由TNTs介導(dǎo)，而TNTs中線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)可能是其重要的組成部分。各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=69.97，P<0.01)，見(jiàn)圖3。

2.4 Western blot檢測(cè)KIF5B的表達(dá)水平BM-MSCs經(jīng)魚(yú)藤酮(Rotenone)分別處理24、48 h后，與對(duì)照組比較，KIF5B蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，且BM-MSCs中KIF5B表達(dá)水平明顯高于THP-1細(xì)胞(P<0.001)，見(jiàn)圖4。

圖2 共聚焦顯微鏡下各組細(xì)胞間TNTs中線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn) ×400

A：BMSCs(MitoTracker)+THP-1；B：BMSCs+THP-1(MitoTracker)；Actin-Tracker Green：細(xì)胞骨架F-actin；Mitotracker Red CMXRos：線粒體；DAPI：細(xì)胞核；Merge：疊加效果及局部放大后圖片；白色箭頭指的是沿TNTs轉(zhuǎn)運(yùn)的線粒體

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1細(xì)胞凋亡

A：各組細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果；B：各組細(xì)胞凋亡率；與MC組比較：**P<0.01；與TC組比較：##P<0.01；與SC組比較：▽▽P<0.01

圖4 Western blot法檢測(cè)KIF5B蛋白表達(dá)情況

A：KIF5B(BM-MSCs)；1：Control組；2：Rotenone處理24 h組；3：Rotenone 處理48 h組；與Control組比較：**P<0.01；B：KIF5B(BM-MSCs-THP-1)；4：BM-MSCs組；5：THP-1組；與BM-MSCs組比較：###P<0.001

3 討論

通過(guò)模擬骨髓微環(huán)境建立共培養(yǎng)體系，本研究表明BM-MSCs與THP-1細(xì)胞間能夠遠(yuǎn)距離形成TNTs。以往研究[10]認(rèn)為F-actin的表達(dá)是TNTs的特異性標(biāo)志，本研究通過(guò)Actin-Tracker Green特異性標(biāo)記F-actin，共聚焦顯微鏡下觀察到BM-MSCs與THP-1細(xì)胞間TNTs中存在F-actin。有研究[11]證實(shí)親脂性染料DiO、DiI可以通過(guò)TNTs雙向傳遞。線粒體是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量水平、代謝和凋亡的重要細(xì)胞器，可影響細(xì)胞增殖和分化。近年來(lái)，研究[12]證明線粒體產(chǎn)生的ATP和線粒體局部代謝途徑在AML的進(jìn)展中起著重要作用。本研究使用熒光標(biāo)記追蹤線粒體的方法證明線粒體可以通過(guò)TNTs轉(zhuǎn)運(yùn)，并且發(fā)現(xiàn)線粒體只能由BM-MSCs向THP-1細(xì)胞單向轉(zhuǎn)運(yùn)，而沒(méi)有觀察到線粒體從THP-1細(xì)胞延著TNTs向BM-MSCs轉(zhuǎn)運(yùn)。線粒體只能單向傳遞的機(jī)制尚不明確，Brickley et al[13]研究認(rèn)為神經(jīng)元內(nèi)線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)可能與Miro1、Miro2、TRAK1、KHC等蛋白相關(guān)；Babenko et al[14]研究表明Miro1可以促進(jìn)線粒體從MSCs向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)。Ahmad et al[15]研究發(fā)現(xiàn)Rotenone是一種特異性線粒體抑制劑，可以有效抑制BM-MSCs線粒體向內(nèi)皮細(xì)胞傳遞。本研究用Rotenone誘導(dǎo)BM-MSCs，檢測(cè)Rotenone誘導(dǎo)前、后BM-MSCs馬達(dá)蛋白KIF5B的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Rotenone處理后KIF5B表達(dá)顯著下降。并發(fā)現(xiàn)KIF5B在BM-MSCs中表達(dá)明顯高于THP-1細(xì)胞，這符合濃度梯度動(dòng)力學(xué)模型[15]，這提示 KIF5B可能參與細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)研究了共培養(yǎng)系統(tǒng)中線粒體單向傳遞對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響，Transwell透膜組THP-1細(xì)胞凋亡率較直接共培養(yǎng)組明顯增高，而與THP-1單獨(dú)培養(yǎng)組凋亡率無(wú)明顯差異；Transwell透膜通過(guò)物理阻斷細(xì)胞間TNTs，切斷線粒體傳遞，而不影響細(xì)胞因子及胞外囊泡的作用，這提示直接共培養(yǎng)組THP-1細(xì)胞凋亡下降可能主要受細(xì)胞間TNTs中線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)影響；加入TNTs抑制劑Latrunculin B可以破壞一部分TNTs結(jié)構(gòu)，阻礙部分線粒體傳遞，這可能與加入Latrunculin B組THP-1細(xì)胞凋亡率較直接共培養(yǎng)組增高有關(guān)。