繆 冉，吳立勝，代聰聰，姚寒暉

胃癌是世界上最常見的消化道腫瘤之一，超過70%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家，并且仍然是全球癌癥死亡的主要原因之一[1]。盡管近幾十年來胃癌診斷和治療取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，但5年總生存率仍不令人滿意[2]。因此，進(jìn)一步探索胃癌進(jìn)展中新的生物學(xué)標(biāo)志物對于了解胃癌發(fā)展和設(shè)計治療靶標(biāo)至關(guān)重要。

細(xì)胞的RNA，如mRNA、circRNA、tRNA等，在不同位點攜帶數(shù)百種不同的轉(zhuǎn)錄后加工修飾。6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)是真核生物中mRNA最豐富的內(nèi)部化學(xué)修飾[3]。m6A的動態(tài)調(diào)控蛋白包括甲基轉(zhuǎn)移酶(Writers)、去甲基化酶(Erasers)和讀取基因(Readers)[4]。其甲基轉(zhuǎn)移酶是多組分復(fù)合物，由METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、RBM15和ZC3H13組成[5]。最近研究[6-10]表明，m6A相關(guān)蛋白參與了不同類型癌癥的發(fā)生和發(fā)展，如急性髓性白血病、膽管癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展都有m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的參與。然而，作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的關(guān)鍵組分，KIAA1429在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中的功能作用仍有待確定，該實驗運用慢病毒干擾胃癌細(xì)胞KIAA1429的表達(dá), 觀察其對胃癌細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)的影響并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞株均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。人胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清(美國Gibco公司)和1%青霉素-鏈霉素混合物(美國Gibco公司)的1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)中培養(yǎng)。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)中培養(yǎng)。

1.2 對照/干擾細(xì)胞系的建立人胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)至融合度約70%，然后按照制造商(上海Obio公司)的說明，用KIAA1429干擾慢病毒和pLKD-CMV-G &PR-U6陰性對照載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，病毒轉(zhuǎn)染24 h后更換含有10%血清的新鮮培養(yǎng)基。最后使用含10 μg/ml嘌呤霉素的1640培養(yǎng)基篩選14 d后繼續(xù)擴(kuò)增。所獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的對照組細(xì)胞和干擾組細(xì)胞分別命名為shRNA和shKIAA1429。

1.3 實時熒光定量PCR檢測SGC7901和MGC803細(xì)胞中KIAA1429 mRNA表達(dá)通過TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，并根據(jù)制造商的說明書用Primescript RT試劑(日本TaKaRa公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過使用StepOne Plus Real-time PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)，用SYBR Green RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)進(jìn)行所有qRT-PCR的mRNA分析。以下引物用于qRT-PCR，KIAA1429上游引物：5′-GAGTAAGAGCCCATAGCAGT-3′，下游引物：5′-TAGCACCAGACCATCAGTATTCAC-3′；β-actin上游引物：5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物：5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。PCR反應(yīng)總體系為10 μl：ddH2O 3.2 μl、Rox 0.2 μl、上游和下游引物各0.3 μl、Mix 5 μl、cDNA 1 μl。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，設(shè)置40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt方法計算mRNA表達(dá)的相對變化。

1.4 Western blot法檢驗KIAA1429蛋白水平選取生長狀態(tài)良好的胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞，加入蛋白裂解緩沖液及蛋白酶抑制劑(上海碧云天公司)冰上放置20 min后刮取細(xì)胞裂解物，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液并使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(上海碧云天公司)定量蛋白質(zhì)，加入蛋白上樣緩沖液(5×)后水浴煮沸5 min使其充分變性，后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。制?2% SDS-PAGE，以β-actin作為內(nèi)參，加入蛋白并電泳。將蛋白以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后分別將膜放入用一抗稀釋液稀釋配制的KIAA1429和β-actin抗體中，4 ℃孵育過夜。次日將PVDF膜清洗3次后，分別加入羊抗兔IgG抗體(1 ∶5 000，美國CST公司)和兔抗小鼠IgG抗體(1 ∶5 000，美國CST公司)，室溫?fù)u床孵育1 h。再將PVDF膜清洗3次后，加入顯色液，曝光并觀察結(jié)果。

1.5 Transwell細(xì)胞遷移侵襲實驗① 細(xì)胞遷移實驗選取生長狀態(tài)良好的胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞，以0.25%胰酶消化，終止消化后離心棄去培養(yǎng)基，用不含血清的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105/ml。反復(fù)多次吹打混勻細(xì)胞懸液后，取200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室。24孔板下室中加入600 μl含10%血清的1640培養(yǎng)基，輕輕搖勻后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用棉簽輕輕擦掉上室細(xì)胞，PBS洗3次，甲醇固定細(xì)胞30 min，適當(dāng)風(fēng)干小室后，使用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3次，風(fēng)干小室。將小室置于顯微鏡下，隨機(jī)選取4個視野觀察細(xì)胞，拍照并記數(shù)。② 細(xì)胞侵襲實驗將Matrigel 基質(zhì)膠與1640培養(yǎng)基進(jìn)行1 ∶15比例稀釋后包被Transwell小室上室，置于37 ℃培養(yǎng)箱30 min使其聚合成凝膠，使用前進(jìn)行基底膜水化，后續(xù)實驗步驟與細(xì)胞遷移實驗相同。

1.6 細(xì)胞劃痕實驗選取生長狀態(tài)良好的胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞，以0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔8×104個將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至覆蓋皿底80%以上時，使用100 μl移液槍槍頭在培養(yǎng)板上做十字劃線，棄培養(yǎng)基，PBS清洗3次更換新鮮培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察并拍照后放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后再次棄培養(yǎng)基，PBS清洗3次更換新鮮培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察并拍照細(xì)胞的遷移愈合情況，評價其轉(zhuǎn)移能力。

1.7 Western blot法分別檢測shRNA和shKIAA1429細(xì)胞中E-Cadherin、N-Cadherin蛋白的表達(dá)水平分別收集SGC7901、MGC803 shRNA 和 shKIAA1429 細(xì)胞，按1.4節(jié)的方法檢測細(xì)胞中E-Cadherin及N-Cadherin蛋白的表達(dá)水平(1 ∶1 000，抗體均購自美國CST公司)。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染抑制KIAA1429 mRNA表達(dá)將KIAA1429干擾慢病毒載體和pLKD-CMV-G &PR-U6對照載體感染胃癌細(xì)胞，應(yīng)用實時熒光定量PCR法分別檢測胃癌SGC7901、MGC803細(xì)胞shRNA組和shKIAA1429組KIAA1429 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與shRNA組比較，shKIAA1429組KIAA1429 mRNA 的表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=20.402、15.627,P<0.05)。見圖1。

圖1 實時熒光定量PCR檢測KIAA1429 mRNA水平

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染抑制KIAA1429蛋白表達(dá)進(jìn)一步使用Western blot法檢測胃癌SGC7901、MGC803細(xì)胞shRNA組和shKIAA1429組KIAA1429蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示shKIAA1429組KIAA1429蛋白相對表達(dá)量低于shRNA組(圖2)。這與實時熒光定量PCR的檢測結(jié)果一致，說明在SGC7901和MGC803細(xì)胞中成功抑制KIAA1429基因的表達(dá)，可以用于后續(xù)實驗。

圖2 Western blot法檢測KIAA1429 蛋白表達(dá)水平

A1:胃癌SGC7901細(xì)胞的shRNA組; B1:胃癌SGC7901細(xì)胞的shKIAA1429組; A2: 胃癌MGC803細(xì)胞的shRNA組; B2:胃癌MGC803細(xì)胞的shKIAA1429組

2.3 干擾KIAA1429抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲分別對SGC7901和MGC803細(xì)胞進(jìn)行Transwell細(xì)胞實驗。遷移實驗結(jié)果(圖3A)顯示，24 h后shKIAA1429組細(xì)胞遷移個數(shù)較shRNA組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.111、5.662,P<0.05)。同時侵襲實驗結(jié)果(圖3B)顯示，shKIAA1429組的細(xì)胞遷移率在24 h較shRNA組低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.523、14.581,P<0.05)。

2.4 干擾KIAA1429抑制胃癌細(xì)胞的劃痕愈合能力為進(jìn)一步分析KIAA1429對胃癌SGC7901和MGC803細(xì)胞遷移的影響, 采用劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力。 與shRNA組比較，24 h時shKIAA1429組劃痕愈合率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.836、10.305,P<0.05) 。見圖4。

2.5 干擾KIAA1429影響 E-Cadherin、N-Cadherin蛋白表達(dá)應(yīng)用Western blot法檢測shRNA組和shKIAA1429組細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)分子標(biāo)志物的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與shRNA組比較，shKIAA1429組細(xì)胞N-Cadherin蛋白表達(dá)減少, E-Cadherin蛋白表達(dá)增加，見圖5。

3 討論

最近研究表明，m6A基轉(zhuǎn)移酶參與了不同類型癌癥的發(fā)生和發(fā)展，如WTAP在白血病細(xì)胞的異常增殖中起重要作用[6]；同時在膽管癌特別是在淋巴結(jié)或血管內(nèi)的轉(zhuǎn)移性膽管癌細(xì)胞中過度表達(dá)：WTAP的過度表達(dá)或干擾分別顯著增加或減少膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲[7]。Cui et al[8]發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(GSCs)中，METTL3沉默誘導(dǎo)的m6A水平降低導(dǎo)致癌基因如ADAM19、EPHA3和KLF4的上調(diào)，同時下調(diào)CDKN2A和BRCA2等腫瘤抑制因子的表達(dá)。但是Visvanathan et al[9]得到了相反的結(jié)論，他們發(fā)現(xiàn)METTL3介導(dǎo)的m6A修飾是GSC維持所必需的，研究結(jié)果表明METTL3在GSCs中上調(diào)，METTL3的沉默則下調(diào)膠質(zhì)瘤重編程因子POU3F2、SOX2、SALL2和OLIG2以抑制GSCs的生長。對于肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，抑制METTL14增強(qiáng)了HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，過表達(dá)METTL14則抑制細(xì)胞遷移和侵襲[10]。最近研究[11]表明，KIAA1429作為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶多蛋白復(fù)合物的催化成分之一，在腫瘤進(jìn)展中同樣起著至關(guān)重要的作用。然而，KIAA1429對胃癌的發(fā)生發(fā)展有何意義，目前尚無相關(guān)報道。

圖3 Transwell細(xì)胞實驗檢測胃癌細(xì)胞遷移、侵襲能力

圖4 劃痕實驗檢測胃癌細(xì)胞遷移能力

與shRNA組比較：*P<0.05

圖5 Western blot法檢測胃癌細(xì)胞中E-Cadherin、N-Cadherin蛋白相對表達(dá)水平

A1:胃癌SGC7901細(xì)胞shRNA組; B1:胃癌SGC7901細(xì)胞shKIAA1429組; A2: 胃癌MGC803細(xì)胞shRNA組; B2:胃癌MGC803細(xì)胞shKIAA1429組

為探索KIAA1429在胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性中的作用，本研究選取胃癌細(xì)胞系SGC7901和MGC803進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示shKIAA1429組mRNA和蛋白表達(dá)量較shRNA組顯著降低，驗證了轉(zhuǎn)染模型成功建立。通過Transwell細(xì)胞侵襲實驗，發(fā)現(xiàn)干擾胃癌細(xì)胞KIAA1429基因后，細(xì)胞的侵襲能力隨之降低。接著Transwell細(xì)胞轉(zhuǎn)移實驗以及細(xì)胞劃痕試驗結(jié)果表明，減少KIAA1429基因表達(dá)，胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力也隨之降低?？傊緦嶒灡砻鱇IAA1429基因的表達(dá)可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

EMT是胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵驅(qū)動因素，在胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的早期階段發(fā)揮著重要作用。 EMT誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移并通過淋巴系統(tǒng)和血液到達(dá)其轉(zhuǎn)移生態(tài)位。 并且EMT表型與惡性胃癌階段相關(guān)[12]。EMT是一個復(fù)雜的多步驟過程, 它不僅是一種復(fù)雜的形態(tài)學(xué)變化過程, 同時與幾種上皮和間充質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)水平改變有關(guān)[13]。本研究顯示, KIAA1429基因表達(dá)受到抑制后, 胃癌細(xì)胞中EMT過程受到抑制, 表現(xiàn)為E-Cadherin表達(dá)上調(diào)而N-Cadherin表達(dá)下調(diào)。這表明抑制KIAA1429基因的表達(dá)，減弱了胃癌細(xì)胞SGC7901和MGC803細(xì)胞侵襲和遷移的能力, 其中的機(jī)制可能與EMT過程受到抑制有關(guān)。