徐永偉，李 路，武 藝，章文慧，邢瑞欣，羅慶禮，沈繼龍，陳 熙

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii, Tg)是一種機(jī)會(huì)致病性的專性有核細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，且全球廣泛傳播，可以感染幾乎所有溫血?jiǎng)游?。已知來源于北美及歐洲人獸弓形蟲蟲株主要有三個(gè)基因型，即Type Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型；而中國(guó)則以Chinese 1(ToxoDB#9)型為優(yōu)勢(shì)基因型[1]。弓形蟲株毒力與不同基因型攜帶的效應(yīng)分子多態(tài)性密切相關(guān)[2]。弓形蟲侵入宿主細(xì)胞后釋放的多態(tài)性效應(yīng)分子蛋白主要包括棒狀體蛋白家族(ROPs family, ROPs)和致密體家蛋白家族(GRAs family, GRAs)，線狀體和類錐體等多種毒力效應(yīng)分子[3]。弓形蟲Ⅰ和Ⅲ型蟲株分泌的ROP16蛋白可以通過旁路激活途徑，直接磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription-3, Stat-3)和信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-6(signal transducer and activator of transcription-6, Stat-6)而激活巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞偏移，增強(qiáng)精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)的合成增加，并釋放出大量的IL-4、IL-10和TGF-β1等細(xì)胞因子，使得TNF-α、IL-12等的生成減少[4-5]，并能誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答。

有研究[6]證實(shí)LPS和IFN-γ則通過經(jīng)典途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞偏移，在機(jī)體抗感染、抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。但是過度的M1激活及其誘導(dǎo)的Th1應(yīng)答也可導(dǎo)致組織的炎癥反應(yīng)，且在自身免疫性疾病中造成病理?yè)p傷[7]。有研究[8]表明，M2和M1細(xì)胞在機(jī)體的免疫環(huán)境中能夠進(jìn)行相互的轉(zhuǎn)化偏移，使得免疫反應(yīng)處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中，影響著疾病的發(fā)生和發(fā)展。該研究旨在通過慢病毒介導(dǎo)ToxoROP16Ⅰ/Ⅲ，穩(wěn)轉(zhuǎn)RAW264.7(Mφ)并驅(qū)動(dòng)向M2型細(xì)胞偏移。經(jīng)過與M1型細(xì)胞混合培養(yǎng)，觀察M2下調(diào)炎性細(xì)胞因子的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系RAW264.7(RAW264.7,Mφ)，由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，細(xì)胞在含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，并在-80 ℃液氮凍存。

1.1.2重組質(zhì)粒和慢病毒包裝ToxoROP16Ⅰ/Ⅲ(2 124 bp, ToxoDB.org)來源于PRU株RNA和WH3速殖子RNA, 構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP，定向克隆pEGFP-ROP16Ⅰ/Ⅲ，重組含有綠色熒光蛋白和嘌呤霉素抗性標(biāo)記的慢病毒載體。慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因包裝。

1.1.3主要試劑 FBS(加拿大Wistent公司)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)、DMEM培養(yǎng)基、甲醛、BCA試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液(上海碧云天公司)；LPS(美國(guó)Sigma公司)；TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)；硝酸纖維膜(美國(guó)Billerica公司)；小鼠抗兔Arg-1、內(nèi)參β-actin和山羊抗小鼠/兔IgG抗體(武漢Proteintech公司)；兔抗鼠iNOS抗體(美國(guó)Abcam公司)；小鼠抗兔PD-L2抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；引物合成(上海Sangon公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Mφ培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中,在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代并冷凍。Mφ的正常狀態(tài)是一種圓形的、未伸展的、未分化的狀態(tài)，稱為初始狀態(tài)細(xì)胞。

1.2.2重組慢病毒ROP16Ⅰ/Ⅲ穩(wěn)轉(zhuǎn)Mφ 在6孔培養(yǎng)板中每孔加入1 ml不含抗生素的完全培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，總數(shù)2×106個(gè)/每孔。設(shè)立正常組(Mφ)、慢病毒空載對(duì)照組(Lv-Mφ)和慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組(Lv-ROP16Ⅰ/Ⅲ-Mφ)。根據(jù)感染復(fù)數(shù)，將慢病毒稀釋至滴度為1×108TU/ml，并加入細(xì)胞轉(zhuǎn)染增強(qiáng)試劑進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞至于原有的條件下37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。8～12 h以后根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，更換為新的完全培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染2～3 d后，觀察轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。因綠色熒光蛋白包含在ROP16Ⅰ/Ⅲ的慢病毒質(zhì)粒內(nèi)，則可在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞發(fā)出綠色熒光。

1.2.3Western blot檢測(cè) 將上述細(xì)胞進(jìn)行分組后，收集經(jīng)過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Mφ，將預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2次，根據(jù)說明書，按照每孔150 μl的體積加入細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打，同時(shí)在冰上敷10 min, 然后4 ℃、12 000 r/min條件下離心5 min，上清液即細(xì)胞總蛋白溶液，BCA法測(cè)蛋白濃度。配制SDS-PAGE膠，根據(jù)蛋白濃度進(jìn)行上樣，電泳(60 V 50 min、110 V、60 min)，轉(zhuǎn)模(110 V、90 min)，用溶于TBST的5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，并且在室溫的條件下進(jìn)行孵育1 h后，加入ROP16Ⅰ/Ⅲ(1 ∶500)、Arg-1和iNOS(1 ∶1 000)、PD-L2(1 ∶1 500)小鼠單克隆抗體，室溫孵育1 h，置于4 ℃環(huán)境中過夜，過夜后用 TBST洗滌3次，每次10 min， 隨即加入相應(yīng)二抗(1 ∶1 500)，室溫孵育1 h，孵育完成后用TBST洗滌。加入顯影液后，進(jìn)行拍照分析。并分析條帶灰度值。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)mRNA水平的變化 每組細(xì)胞收集后，加入PBS 重懸細(xì)胞進(jìn)行清洗，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，吸棄上清液，將細(xì)胞置于冰上提取細(xì)胞總RNA，每管加入1 ml TRIzol進(jìn)行細(xì)胞裂解，提取總RNA樣品，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA等操作的方法均根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)條件為：預(yù)變性(94 ℃、變性3～5 min)，變性(94 ℃、變性1 min)，退火(50～60 ℃ 退火1 min)，延伸(70～75 ℃、延伸1 min)，循環(huán)重復(fù)變性至延伸步驟，延伸補(bǔ)平(70～75 ℃延伸10 min),4 ℃終止。以β-actin為內(nèi)參，引物見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)對(duì)組間同一參數(shù)進(jìn)行比較，以P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒ROP16Ⅰ/Ⅲ轉(zhuǎn)染Mφ使用空載慢病毒和重組慢病毒ROP16Ⅰ/Ⅲ穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入Mφ細(xì)胞，并使用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達(dá)情況以及通過Western blot技術(shù)分析，Lv-ROP16Ⅰ/Ⅲ成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)。通過灰度值進(jìn)行計(jì)算，與空載慢病毒組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見圖1。

2.2 LPS刺激Mφ偏移提取細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞總RNA進(jìn)行檢測(cè)分析，其中Western blot結(jié)果顯示，與正常組(Mφ組)比較，LPS+Mφ組中iNOS(1 ∶1 500)表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=285.3,P<0.01)。通過qRT-PCR檢測(cè)LPS+Mφ細(xì)胞組中的TNF-α(F=39.74,P<0.001)、IL-1β(F=30.9,P<0.001)和iNOS(F=12.2,P<0.001)的mRNA的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明LPS刺激Mφ向M1型炎性細(xì)胞方向偏移。見圖2。

圖1 重組慢病毒ROP16Ⅰ/Ⅲ穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Mφ細(xì)胞

A：熒光顯微鏡下觀察慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)情況×40；B：Western blot檢測(cè)慢病毒ROP16Ⅰ/Ⅲ轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)；C：灰度值計(jì)算慢病毒ROP16Ⅰ/Ⅲ穩(wěn)轉(zhuǎn)；1: Mφ組；2：Lv-Mφ組；3：Lv-ROP16Ⅰ/Ⅲ-Mφ組；與Mφ組比較：***P<0.001

2.3 重組慢病毒Lv-ROP16Ⅰ/Ⅲ穩(wěn)轉(zhuǎn)Mφ偏移提取細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞總RNA進(jìn)行檢測(cè)分析，其中Western blot 結(jié)果顯示Lv-ROP16Ⅰ/Ⅲ-Mφ細(xì)胞組中的Arg-1(1 ∶1 500)見圖3A，PD-L2(1 ∶1 000)見圖3B，與空載慢病毒組Lv+Mφ組比較，Arg-1(F=5.8,P<0.05)和PD-L2(F=4.15,P<0.1)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過qRT-PCR檢測(cè)Lv-ROP16Ⅰ/Ⅲ-Mφ組中的IL-10、TGF-β1和Arg-1的mRNA的表達(dá)，與空載慢病毒組的Lv-Mφ組比較，IL-10(F=43.1,P<0.01)、TGF-β1 (F=30.2,P<0.01)和Arg-1(F=29.4,P<0.01)表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明重組慢病毒Lv-ROP16Ⅰ/Ⅲ穩(wěn)轉(zhuǎn)Mφ向M2型巨噬細(xì)胞偏移。見圖3。

2.4 Western blot 測(cè)M1和M2混合培養(yǎng)iNOS、Arg-1和PD-L2表達(dá)M1和M2細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，通過Western blot檢測(cè)M1+M2混合培養(yǎng)細(xì)胞組中的Arg-1和PD-L2的蛋白表達(dá)穩(wěn)定，與LPS+Mφ組比較，Arg-1(F=37.33,P<0.001)和PD-L2(F=303.3,P<0.001)表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與LPS+Mφ組比較，iNOS蛋白表達(dá)降低(F=179.3，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

圖2 LPS刺激Mφ向M1型細(xì)胞偏移

A：Western blot檢測(cè)iNOS蛋白的表達(dá)；B：灰度值計(jì)算iNOS的值；C、D、E：檢測(cè)M1型細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、iNOS的mRNA表達(dá)情況；1: Mφ組；2：LPS+Mφ組；3：Lv-Mφ組；4：Lv-ROP16Ⅰ/Ⅲ-Mφ組；與Mφ組比較：**P<0.01,***P<0.001

圖3 Lv-ROP16Ⅰ/Ⅲ穩(wěn)轉(zhuǎn)Mφ向M2型細(xì)胞偏移

A：Western blot檢測(cè)Arg-1蛋白的表達(dá)；B：Western blot檢測(cè)PD-L2蛋白的表達(dá)；C、D：分別使用灰度值計(jì)算Arg-1和PD-L2的值；E、F、G：檢測(cè)M2型細(xì)胞中IL-10、TGF-β1和Arg-1的mRNA表達(dá)；1: Mφ組；2：LPS+Mφ組；3：Lv-Mφ組；4：Lv-ROP16Ⅰ/Ⅲ-Mφ組；與Lv-Mφ組比較：*P<0.05,**P<0.01

2.5 qRT-PCR測(cè)M1和M2混合培養(yǎng)IL-1β、TNF-α和iNOS表達(dá)提取細(xì)胞總RNA，通過qRT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)分析，M1+M2細(xì)胞組中IL-10、TGF-β1和Arg-1的mRNA表達(dá)與轉(zhuǎn)染慢病毒組相比，表達(dá)穩(wěn)定。與LPS+Mφ組相比，IL-1β(F=9.3，P<0.01)、TNF-α(F=2.27，P<0.001)和iNOS(F=87.6,P<0.01)表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖5。

3 討論

巨噬細(xì)胞在機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，在抵抗病原感染的過程中最先發(fā)揮吞噬、降解、抗原遞呈以及殺傷病原體等重要作用，是機(jī)體中免疫反應(yīng)中重要的免疫細(xì)胞[9]。巨噬細(xì)胞具有高度的異質(zhì)性和可塑性[10]，在多種病變組織中，如腫瘤、燒傷、炎癥、感染、某些自身免疫性疾病及肥胖等，都可見大量的M1/Th1炎性細(xì)胞。這些炎性細(xì)胞與疾病的發(fā)生、發(fā)展及并發(fā)癥的產(chǎn)生密切相關(guān)。

已知單核巨噬細(xì)胞在不同的組織微環(huán)境狀態(tài)下，可向M1型或者M(jìn)2型細(xì)胞偏移或極化[11-12]。巨噬細(xì)胞極化的狀態(tài)不同，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著不同的作用。極化的M1型巨噬細(xì)胞以分泌促炎因子為主,如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-12等，具有強(qiáng)大的抗原提呈及吞噬能力，促進(jìn)Th1免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗胞內(nèi)病原菌和抗腫瘤的作用，同時(shí)在機(jī)體的免疫應(yīng)答中發(fā)揮促炎作用[13]，但也會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。M2型巨噬細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子如IL-10、IL-13、TGF-β1以及表達(dá)Arg-1等，具有抗炎的免疫調(diào)控作用，能促進(jìn)組織修復(fù)和傷口愈合[14]。

圖4 Western blot 測(cè)M1和M2混合培養(yǎng)中iNOS、Arg-1和PD-I2表達(dá)

A：Western blot檢測(cè)Arg-1和iNOS蛋白的表達(dá)；B、C：分別使用灰度值計(jì)算Arg-1和iNOS的值；D：Western blot檢測(cè)PD-L2蛋白的表達(dá)；E 使用灰度值計(jì)算PD-L2的值；1: Mφ組；2：LPS+Mφ組；3：Lv-Mφ組；4：Lv-ROP16Ⅰ/Ⅲ-Mφ組；5：M1+M2組；與LPS+Mφ組比較：**P<0.01,***P<0.001

圖5 qRT-PCR測(cè)M1和M2混合培養(yǎng)細(xì)胞中IL-1β、TNF-α和iNOS表達(dá)

A：IL-10；B：TGF-β1；C：Arg-1；D：IL-1β；E：TNF-α；F：iNOS；1: Mφ組；2：LPS+Mφ組；3：Lv-Mφ組；4：Lv-ROP16Ⅰ/Ⅲ-Mφ組；5：M1+M2組；與LPS+Mφ組比較：**P<0.01,***P<0.001

在某些特定的微環(huán)境中，由于巨噬細(xì)胞可塑性的特性，可誘導(dǎo)其偏移，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用。

弓形蟲是一種細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，具有多樣的遺傳結(jié)構(gòu)。在動(dòng)物和人類的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)Chinese 1是中國(guó)的優(yōu)勢(shì)基因型[1]。已知Ⅰ/Ⅲ型弓形蟲分泌的激酶效應(yīng)分子ROP16Ⅰ/Ⅲ能夠直接磷酸化STAT3/STAT6轉(zhuǎn)錄因子，經(jīng)旁路激活途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞極化[15]。在Th2炎癥反應(yīng)過程中有M2型巨噬細(xì)胞聚集，例如蠕蟲感染和哮喘。這些免疫反應(yīng)與IL-4和IL-13的產(chǎn)生、嗜酸細(xì)胞增多有關(guān)[10]。此外，M2型巨噬細(xì)胞在抑制Th1型免疫應(yīng)答發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)以LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Mφ向M1極化，后者表達(dá)炎性因子TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA的表達(dá)與正常組相比明顯增高；以ROP16Ⅰ/Ⅲ驅(qū)動(dòng)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞偏移，后者分泌表達(dá)的IL-10、TGF-β1和Arg-1的mRNA與空載慢病毒相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過體外建立巨噬細(xì)胞可塑性模型，探討蟲源性多肽誘導(dǎo)的M2對(duì)過度的M1應(yīng)答發(fā)揮調(diào)解作用，旨在為M1-Th1型應(yīng)答相關(guān)的炎癥以及某些自身免疫性疾病的免疫治療提供新的思路和策略。

在M1和M2細(xì)胞的混合培養(yǎng)中，ROP16Ⅰ/Ⅲ誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞分泌的抗炎因子，如TGF-β1和IL-10明顯升高；而M1型炎性細(xì)胞分泌的促炎因子如IL-1β、TNF-α和iNOS的mRNA表達(dá)明顯降低，抑制了炎癥因子的分泌。這可能與M2型細(xì)胞逆轉(zhuǎn)M1型細(xì)胞的偏移有關(guān)，而發(fā)揮M2型細(xì)胞的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用[16]。

本研究中以慢病毒介導(dǎo)的弓形蟲棒狀體分泌的ROP16Ⅰ/Ⅲ穩(wěn)轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞，可驅(qū)動(dòng)其向M2型巨噬細(xì)胞極化，持續(xù)分泌抑炎癥因子，調(diào)解炎性反應(yīng)。與IL-4和IL-13相比，ROP16Ⅰ/Ⅲ激活M2巨噬細(xì)胞偏移更具有靶向性和更高的安全性，因此對(duì)于研究M1-Th1型免疫應(yīng)答相關(guān)的炎癥病理及其干預(yù)具有重要理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。