馬 濤，王 倩，程治源，葉 挺，張宸銘，盛 瑛，宗剛軍,

血管鈣化(vascular calcification，VC)是高血壓病、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性腎衰竭以及糖尿病血管病變共同的病理學(xué)改變。有研究[1-2]表明VC過(guò)程復(fù)雜，與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病和慢性腎病患者的心血管發(fā)病率和死亡率增加有關(guān)[3]。然而，目前并沒(méi)有針對(duì)VC特效的治療方法。

Ghrelin又稱生長(zhǎng)激素釋放肽或胃饑餓素，是由氨基酸殘基組成的小分子多肽[4-5]，在心血管系統(tǒng)方面，有研究[6-7]顯示Ghrelin能夠阻礙炎癥細(xì)胞聚集和活化，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。而VC是動(dòng)脈粥樣硬化晚期繼發(fā)性改變之一，由此可以推測(cè)Ghrelin在一定程度上可以抑制VC的發(fā)展。該研究擬建立大鼠VC模型，探討Ghrelin與VC程度之間的作用，旨在尋找干預(yù)鈣化的新靶點(diǎn)，為延緩VC進(jìn)程提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料雄性SPF級(jí)SD大鼠40只由江蘇省血吸蟲病防治研究所(無(wú)錫)提供，平均8周齡，體質(zhì)量160～250 g；尼古丁購(gòu)自美國(guó)Merck公司；維生素D3(vitamin D3，VD3)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，純度>99%，Ghrelin購(gòu)自杭州中肽生物有限公司，純度> 99%；鈣離子及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶公司；骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)、BMP-4試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；BMP-2、BMP-4、Ghrelin抗體及β-肌動(dòng)蛋白抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑由杭州聯(lián)科生物公司提供。

1.2 VC模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組將40只同一批次SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，分別為鈣化組(vascular calcification，VC)、對(duì)照組(control，CON)、鈣化+低濃度Ghre組(low concentration-Ghrelin，L-Ghre)、鈣化+高濃度Ghre組(high concentration-Ghrelin，H-Ghre)。VC組：第1天8 ∶00 am用VD3溶解于無(wú)水乙醇(30萬(wàn)U/kg)肌肉注射，尼古丁溶解于花生油(25 mg/kg)8 ∶00 am，6 ∶00 pm各灌胃1次。CON組：同樣時(shí)間用同等量的無(wú)水乙醇肌肉注射，花生油灌胃。L-Ghre組：用同鈣化組相同方法建立模型的基礎(chǔ)上給予Ghrelin 50 μg/kg，腹腔注射，每日1次，持續(xù)4周。H-Ghre組：在鈣化模型基礎(chǔ)上給予Ghrelin 100 μg/kg，腹腔注射，每日1次，持續(xù)4周。所有大鼠常規(guī)飼料、純凈水喂養(yǎng)，定期更換飼料、飲用水及墊料，每日觀察并記錄大鼠活力，每周稱重。4周后4組大鼠稱重后均在10%丙戊酸鈉麻醉后心臟取血，3 000 r/min、10 min離心后取上清液，-80 ℃保存待測(cè)。解剖大鼠取胸主動(dòng)脈1 cm，10%中性福爾馬林固定留待切片染色。

1.3 Von Kossa切片染色將固定于10%中性福爾馬林的1 cm胸主動(dòng)脈常規(guī)脫水包埋，切片厚度5 μm常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗1 min，切片入Von Kossa銀溶液在紫外燈下強(qiáng)光照射30 min后蒸餾水再洗1 min，切片用海波溶液處理2 min后蒸餾水沖洗3次，HE染色復(fù)染細(xì)胞核，脫水透明，中性樹膠封固。

1.4 血清Ca2+、ALP含量測(cè)定大鼠血清離心后上清液中的Ca2+、ALP含量用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，具體操作步驟按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 免疫組化法檢測(cè)胸主動(dòng)脈BMP-2、BMP-4表達(dá)石蠟包埋的血管組織切片4 μm，脫蠟洗滌，抗原修復(fù)，分別加入BMP-2、BMP-4抗體4 ℃過(guò)夜，復(fù)溫洗滌后滴加二抗，洗滌加顯色液后蘇木精復(fù)染5～10 min。

1.6 胸主動(dòng)脈BMP-2、BMP-4含量測(cè)定取大鼠胸主動(dòng)脈段血管組織20 mg加入裂解液進(jìn)行冰浴勻漿4 ℃、3 000 r/min離心10 min后取上清液，用 BMP-2、BMP-4 ELISA試劑盒測(cè)定其含量。

1.7 胸主動(dòng)脈BMP-2、BMP-4、Ghrelin蛋白表達(dá)取胸主動(dòng)脈并剪成細(xì)小碎片，加入終濃度為1 mmol/L的PMSF，每20 mg組織加入200 μl的RIPA裂解液并震蕩裂解液，玻璃器勻漿至充分裂解，12 000 r/min離心5 min取上清液，加入上樣緩沖液并煮沸，再次離心，其余步驟按照Western blot方法進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 Von Kossa染色觀察4組大鼠胸主動(dòng)脈VC程度通過(guò)Von Kossa染色切片觀察可見(jiàn)CON組血管壁呈紅色未見(jiàn)黑褐色鈣鹽沉積，VC組胸主動(dòng)脈壁中層可見(jiàn)大量黑褐色至深黑色鈣鹽沉積，H-Ghre組鈣化程度小于L-Ghre組，兩組鈣化程度均明顯小于VC組，并且高于CON組，見(jiàn)圖1。

2.2 4組大鼠體質(zhì)量及血清Ca2+、ALP含量測(cè)定4組體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.998，P>0.05)，ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示：L-Ghre組血清Ca2+、ALP含量均高于H-Ghre組和CON組，但低于VC組血清Ca2+、ALP含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.102，P<0.05；F=66.390，P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 相關(guān)鈣化因子的表達(dá)免疫組化法檢測(cè)4組大鼠胸主動(dòng)脈BMP-2、BMP-4的表達(dá)：BMP-2、BMP-4在CON組幾乎無(wú)表達(dá)，在VC組表達(dá)最明顯呈棕黃色，H-Ghre組BMP-2、BMP-4的表達(dá)低于L-Ghre組(圖2)。ELISA法測(cè)4組大鼠胸主動(dòng)脈BMP-2、BMP-4含量，VC組含量最高，L-Ghre組高于H-Ghre組，CON組最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.792，P<0.05；F=11.472，P<0.05)(表2)。Western blot結(jié)果顯示：VC組中BMP-2、BMP-4的表達(dá)均較其他三組明顯升高，H-Ghre組與L-Ghre組比較BMP-2、BMP-4表達(dá)均降低且高于CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖1 4組大鼠胸主動(dòng)脈切片Von Kossa染色結(jié)果 ×200

項(xiàng)目VC組CON組L-Ghre組H-Ghre組F值體質(zhì)量(g)385.10±12.65359.10±61.23#349.70±32.64#△356.70±10.25*#△0.998血清Ca2+含量(mg/dl)17.81±1.045.54±2.09#13.30±1.41#△8.47±1.29*#△64.102血清ALP含量(U/L)172.00±15.2145.95±14.71#117.10±18.05#△51.58±17.35*#△66.390

與L-Ghre組比較：*P<0.05； 與VC組比較：#P<0.05；與CON組比較：△P<0.05

圖2 4組大鼠免疫組化法測(cè)胸主動(dòng)脈上BMP-2、BMP-4表達(dá) ×200

鈣化因子VC組CON組L-Ghre組H-Ghre組F值BMP-2含量(pg/dl)175.38±23.8594.50±14.14#144.83±19.20#△125.34±9.04*#△13.792BMP-4含量(pg/dl)144.30±17.9089.67±16.04#131.30±12.35#△115.60±8.46*#△11.472

與L-Ghre組比較：*P<0.05； 與VC組比較：#P<0.05；與CON組比較：△P<0.05

圖3 Western blot檢測(cè)4組大鼠胸主動(dòng)脈BMP-2、BMP-4的表達(dá)

2.4 4組大鼠胸主動(dòng)脈Ghrelin蛋白表達(dá)差異檢測(cè)相比于CON組，VC組給予尼古丁灌胃聯(lián)合VD3肌注，Western blot結(jié)果顯示VC組和CON組Ghrelin蛋白表達(dá)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖4。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所用的建模方法并不會(huì)對(duì)大鼠體內(nèi)Ghrelin水平產(chǎn)生明顯影響。

圖4 Western blot檢測(cè)4組大鼠胸主動(dòng)脈Ghrelin的表達(dá)

3 討論

隨著社會(huì)老齡化的日益加劇，VC顯著增加了心血管病的發(fā)病率，因此受到越來(lái)越多的關(guān)注。VC是臨床上比較常見(jiàn)的疾病，尤其在腎功能衰竭、脂質(zhì)代謝異常及糖尿病血管病變的患者中更常見(jiàn)，既往的觀點(diǎn)認(rèn)為VC是鈣鹽在血管壁被動(dòng)沉積的過(guò)程，是鈣磷代謝紊亂的結(jié)果，炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡會(huì)加劇VC化進(jìn)展[8]。近年研究[9]表明VC是多因素參與的與骨細(xì)胞代謝、軟骨發(fā)育相關(guān)的一個(gè)可以主動(dòng)調(diào)控的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予VD3和尼古丁建立大鼠VC模型，利用Von Kossa染色可以明顯看到動(dòng)脈中層有大量黑褐色鈣鹽沉積，通過(guò)ELISA法、免疫組化法以及Western blot方法檢測(cè)可以看到鈣離子、ALP及BMP-2、BMP-4等鈣化相關(guān)指標(biāo)明顯增高，證實(shí)了可以通過(guò)VD3聯(lián)合尼古丁可以成功建立大鼠VC模型。通過(guò)對(duì)鈣化組和對(duì)照組的Ghrelin表達(dá)水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)建模方法并不會(huì)影響大鼠自身Ghrelin水平。此外在建立VC模型基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)組給予不同劑量的Ghrelin可以發(fā)現(xiàn) L-Ghre組、H-Ghre組以及VC組之間鈣化指標(biāo)存在差異，H-Ghre組相關(guān)鈣化指標(biāo)低于L-Ghre組和VC組，并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明Ghrelin在一定程度上可以減輕VC的發(fā)展。

目前有關(guān)VC發(fā)生的機(jī)制更多傾向于多因素參與的并且是可以主動(dòng)調(diào)控的過(guò)程，包括細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化(平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞)、炎癥細(xì)胞的遷移與活化、細(xì)胞的自噬和凋亡等有關(guān)。本研究表明外源性Ghrelin在一定程度上有減弱鈣化的作用且高劑量Ghrelin作用更明顯，但其機(jī)制目前并沒(méi)有完全明確，有國(guó)外研究表明通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡因子Bax和Caspase-3的表達(dá)可以減輕細(xì)胞鈣化，但并不是唯一機(jī)制[10-11]，也可以通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK1/2)和磷脂酰肌醇三磷酸激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡減輕鈣化[12-13]，因此可以猜測(cè)Ghrelin抑制VC的機(jī)制之一是通過(guò)激活ERK1/2和PI3K/Akt通路抑制Bax、Caspase-3等凋亡因子表達(dá)最終抑制VC的進(jìn)展。脫?；鵊hrelin是Ghrelin發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要形式，有研究[14]顯示脫?；鵊hrelin可以通過(guò)上調(diào)非編碼RNA-126的表達(dá)增加沉默信息調(diào)節(jié)因子-1和超氧化物的水平歧化酶-2在外周血管內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化損傷，而血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷是導(dǎo)致血管粥樣硬化和鈣化的啟動(dòng)因素之一，因此可以推測(cè)這或許是Ghrelin抑制VC的另一個(gè)可能機(jī)制。目前，有關(guān)Ghrelin的研究尚處于起步階段，而且目前研究?jī)H限于體外細(xì)胞水平，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠VC模型更加逼真的模擬了體內(nèi)環(huán)境，較體外實(shí)驗(yàn)有一定說(shuō)服力，但存在Ghrelin濃度梯度分組少，未準(zhǔn)確提出Ghrelin抑制大鼠VC的可能藥物濃度范圍，這有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。目前Ghrelin在體內(nèi)的作用機(jī)制尚不完全明確，但Ghrelin為臨床上高危鈣化患者減輕鈣化提供了一個(gè)方向，要想作為臨床上的治療手段則需要進(jìn)行更廣泛的研究。