程 鵬，黃振宇，竇賢明，毛 軍，徐雨辰，張賢生

隱睪是指在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，一側(cè)或者雙側(cè)睪丸未能下降到陰囊內(nèi)，又稱為睪丸下降不全，是男性生殖系統(tǒng)中一種常見的先天性疾病。隱睪癥在足月新生兒中的發(fā)病率約為2%～4%，但在早產(chǎn)兒中可達(dá)到30%；但是，大約有80%的隱睪患兒在出生后的第一年內(nèi)睪丸會(huì)下降到陰囊內(nèi)，從而使得隱睪癥的發(fā)病率約為1%[1]。隱睪可以破壞正常的精子發(fā)生，導(dǎo)致男性不育，是成年男性非梗阻性無精癥的一種常見病因，但是其發(fā)病機(jī)制尚不明確。

近年來，越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)icroRNAs(miRNAs)參與精子發(fā)生。miR-101是一種脊椎動(dòng)物中進(jìn)化上保守的miRNA，已被鑒定為前列腺癌中的腫瘤抑制因子[2]。RanBP9是一種腳手架蛋白，研究[3-4]顯示RanBP9敲除的小鼠精子發(fā)生過程嚴(yán)重受損。前期研究[5]表明miR-101在小鼠海馬神經(jīng)元中靶向結(jié)合RanBP9并調(diào)控其表達(dá)，但是miR-101和RanBP9在隱睪中的作用尚未見報(bào)道。該研究通過構(gòu)建隱睪小鼠模型，研究miR-101和RanBP9在隱睪中的表達(dá)變化情況及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞及主要試劑ICR雄性小鼠購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，6周齡，共60只。飼養(yǎng)于室溫24 ℃、濕度50%、通風(fēng)良好環(huán)境中。小鼠精母細(xì)胞系GC-2細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)院饋贈(zèng)；該實(shí)驗(yàn)所用的小鼠miR-101模擬物(miR-101 mimic)、miR-101抑制劑(miR-101 inhibitor)及對(duì)照組購自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗RanBP9抗體、山羊抗兔GAPDH抗體購自abcam公司；蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；免疫熒光二抗：山羊抗兔熒光二抗抗體購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠隱睪造模 將60只ICR小鼠隨機(jī)分為單側(cè)隱睪組和假手術(shù)組，每組各30只。30只隱睪組小鼠麻醉后，將左側(cè)睪丸牽拉至腹腔內(nèi)，切斷引帶，縫合脂肪墊于腹膜上，造左側(cè)隱睪組(Cry組)；右側(cè)睪丸仍位于陰囊內(nèi)，作為自身對(duì)照組(SC組)。另外30只假手術(shù)組小鼠麻醉后做相同腹側(cè)切口，牽拉左側(cè)睪丸，但睪丸仍處于陰囊內(nèi)，左側(cè)睪丸作為對(duì)照組(Con組)。分別于術(shù)后3、7、14、21、28 d行頸椎離斷處死。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 GC-2細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，用胰酶消化，將細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，具體操作步驟嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48 h后收集miR-101 mimic組(記為miR-101)、miR-101 inhibitor組(記為ImiR-101)及其各自對(duì)照組(NC：miR-101 mimic組的對(duì)照組；INC：miR-101 inhibitor組的對(duì)照組)細(xì)胞提取RNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)miR-101的表達(dá)量；收集各組細(xì)胞提取蛋白后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)RanBP9的表達(dá)量。

1.2.3Western blot實(shí)驗(yàn) 將各時(shí)間段收集的小鼠睪丸組織和轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用RIPA裂解液處理30 min，之后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加抗RanBP9抗體(1 ∶1 000)，抗GAPDH抗體(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加ECL顯影液顯影。

1.2.4熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞和各時(shí)間段的小鼠睪丸組織，按TRIzol試劑說明書提取各組總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。引物序列如下：miR-101 F:5′-CACGCATACAGTACTGTG-3′,R:5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′；RanBP9 F: 5′-AATGTGGCAAGAACACAGCA-3′,R:5′-TGGGTCAAGCTGATTTCCAA-3′；18S RNA F:5′-CGCTACTACCGATTGGATGG-3′,R: 5′-AGTTCGACCGTCTTCTCAGC-3′。以18S mRNA表達(dá)水平作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt比較分析各組間miR-101和RanBP9的表達(dá)差異。

1.2.5HE染色 睪丸組織經(jīng)過10%福爾馬林固定24 h后，經(jīng)梯度酒精脫水和二甲苯透明后制作蠟塊。4 μm連續(xù)切片，切片經(jīng)二甲苯、酒精脫蠟水化，蘇木精染色，流水沖洗，鹽酸酒精分化，流水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。切片放入伊紅染液中染色。脫水封片，置于顯微鏡下觀察。

1.2.6免疫熒光染色 4 μm的石蠟切片，60 ℃烘片2 h，經(jīng)二甲苯、酒精脫蠟水化；切片置于檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中抗原修復(fù)，微波爐加熱20 min，自然冷卻到室溫；PBS洗3次，每次5 min；5%BSA封閉30 min；加一抗(1 ∶100)4 ℃過夜；復(fù)溫30 min后PBS洗3次，每次5 min；加相應(yīng)二抗(1 ∶100)室溫孵育1 h(避光)；PBS洗3次，每次5 min；DAPI避光孵育5～10 min，PBS洗3次，每次1 min；封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 小鼠睪丸形態(tài)學(xué)變化術(shù)后3、7、14、21、28 d小鼠體質(zhì)量的改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明手術(shù)對(duì)小鼠的生長(zhǎng)無明顯影響(表1)。術(shù)后3 d Cry組小鼠睪丸較SC組和Con組睪丸稍增大，可能是因?yàn)樾g(shù)后水腫。在術(shù)后14 d時(shí)Cry組睪丸體積明顯減小(圖1A)。通過對(duì)小鼠睪丸體質(zhì)量比(睪丸重量/體質(zhì)量×100%)進(jìn)行分析，如圖1B顯示，在術(shù)后第7天，Cry組較SC組和Con組明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.764，P<0.01)。通過對(duì)睪丸組織進(jìn)行HE染色，術(shù)后3 d Cry組與SC組及Con組進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，生精細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)無明顯改變，術(shù)后7 d開始Cry組睪丸組織生精細(xì)胞數(shù)目開始減少，同時(shí)睪丸結(jié)構(gòu)也出現(xiàn)了損壞，至術(shù)后28 d時(shí)睪丸結(jié)構(gòu)完全破壞，顯微鏡下睪丸組織出現(xiàn)空泡，各級(jí)生精細(xì)胞缺失且不易辨認(rèn)，無法形成完整的精子細(xì)胞；相反，SC組和Con組睪丸組織可見各級(jí)生精細(xì)胞，睪丸組織形態(tài)完好(圖1C)。

表1 各個(gè)時(shí)間段Cry組和Con組小鼠體質(zhì)量比較

2.2 miR-101影響RanBP9在睪丸中的表達(dá)向GC-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-101 mimic和inhibitor 48 h后，qRT-PCR結(jié)果顯示miR-101表達(dá)量在mimic組顯著增加，而在miR-101 inhibitor組表達(dá)量顯著較少, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2A、2B。通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RanBP9的表達(dá)量，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-101 mimic后RanBP9的表達(dá)是減少的，相反，轉(zhuǎn)染miR-101 inhibitor后RanBP9的表達(dá)是增加的(圖2C、2D)。以上結(jié)果表明在生精細(xì)胞系中miR-101可以下調(diào)RanBP9的表達(dá)。

2.3 miR-101和RanBP9在隱睪中的表達(dá)情況qRT-PCR結(jié)果顯示與SC組和Con組相比，隱睪組中miR-101的表達(dá)量在術(shù)后7 d開始升高，而RanBP9的表達(dá)量在術(shù)后14 d出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3A、B。隱睪組睪丸中miR-101表達(dá)量隨著隱睪手術(shù)后時(shí)間的推移發(fā)生改變，從第3天起開始增加，在第14天時(shí)表達(dá)量最高，在第21天和第28天時(shí)稍有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而RanBP9的表達(dá)量在術(shù)后第7天出現(xiàn)減少(P<0.05)，之后RanBP9的表達(dá)量隨著時(shí)間的增加而持續(xù)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4A、B。Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Cry組RanBP9的表達(dá)量隨著手術(shù)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，至第14天后幾乎無RanBP9的表達(dá)，在SC組和Con組中RanBP9的表達(dá)量豐富且無明顯改變，見圖4C、D。

3 討論

目前全世界范圍內(nèi)大約有15%的育齡夫婦不能生育，其中男性因素占50%[6]。隱睪作為一種常見的男性生殖系統(tǒng)先天性疾病，可導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，進(jìn)而影響男性生育能力。近些年來，越來越多的研究[7]表明miRNAs參與精子發(fā)生的過程。Duan et al[1]研究表明miR-210通過靶向結(jié)合NR1D2調(diào)控精子發(fā)生，且證實(shí)了miR-210與隱睪的關(guān)系，其可作為一種生物學(xué)標(biāo)志物，可用于對(duì)隱睪的預(yù)測(cè)作用。Huang et al[8]的研究表明miR-34c通過靶向結(jié)合Nanos2調(diào)控精子發(fā)生，且miR-34c/Nanos2的異常表達(dá)破壞了SSCs自我更新和分化之間的平衡，最終破壞了隱睪睪丸的精子發(fā)生。目前關(guān)于miRNAs在隱睪中的研究較少。

圖1 隱睪小鼠術(shù)后睪丸形態(tài)學(xué)分析

A：術(shù)后不同天數(shù)睪丸肉眼觀大體改變；B：術(shù)后不同時(shí)間段睪丸體質(zhì)量比；C：術(shù)后不同時(shí)間段睪丸HE染色 Bar：100 μm；與SC組比較：**P<0.01，***P<0.001；與Con組比較：##P<0.01，###P<0.001

圖2 miR-101轉(zhuǎn)染后RanBP9的表達(dá)量變化

A：轉(zhuǎn)染miR-101mimic后miR-101的表達(dá)量；B：轉(zhuǎn)染miR-101 inhibitor后miR-101的表達(dá)量；C：轉(zhuǎn)染miR-101 mimic后RanBP9的表達(dá)情況；D：轉(zhuǎn)染miR-101 inhibitor后RanBP9的表達(dá)情況；與NC組比較：***P<0.001；與INC組比較：###P<0.001

圖3 miR-101和RanBP9在隱睪組、SC組和Con組中的表達(dá)情況

A：miR-101在各組睪丸中的表達(dá)情況；B：RanBP9在各組睪丸中的表達(dá)情況；與SC組比較：*P<0.05，**P<0.01；與Con組比較：#P<0.05，##P<0.01

miRNAs是一類小的非編碼RNA分子(通常長(zhǎng)度為19～23個(gè)核苷酸)，通過靶向mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。研究[9-11]表明，miRNA參與許多生物過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和精子發(fā)生。miR-101作為一種脊椎動(dòng)物進(jìn)化上保守的miRNA，在別的系統(tǒng)中的作用已有很多報(bào)道，其表達(dá)水平與某些腫瘤的惡性程度、細(xì)胞增殖的抑制、集落形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]。但miRNA在男性生殖系統(tǒng)中的作用尚不是十分清楚。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建小鼠隱睪模型，通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相較于SC組、Con組、Cry組中miR-101的表達(dá)量是升高的，且miR-101隨著時(shí)間推移而逐漸增加，這表明miR-101的表達(dá)與隱睪是有相關(guān)性的。

RanBP9是一種普遍表達(dá)的腳手架蛋白，主要分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，其可與多種蛋白發(fā)生相互作用而在多種生物過程中起重要作用，如細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、遷移和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[13]。在生殖細(xì)胞中，RanBP9通過與DDX4、種系特異性RNA解旋酶和GASZ(在精母細(xì)胞中廣泛表達(dá)的生殖細(xì)胞蛋白)相互作用而發(fā)揮細(xì)胞功能，并且對(duì)于轉(zhuǎn)座子抑制是必不可少的[14-15]。研究[3-4]表明RanBP9在精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用，敲除了RanBP9的小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的生精障礙。但RanBP9與隱睪的關(guān)系目前尚未見報(bào)道。本研究中，通過qRT-PCR、Western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)RanBP9在隱睪中表達(dá)量是下降的，其減少可能是隱睪小鼠精子發(fā)生障礙的原因之一。

圖4 miR-101和RanBP9在隱睪不同時(shí)間段表達(dá)情況

A：術(shù)后不同時(shí)間miR-101的表達(dá)情況；B：術(shù)后不同時(shí)間RanBP9的表達(dá)情況；C：術(shù)后不同時(shí)間RanBP9蛋白的表達(dá)情況；D：術(shù)后不同時(shí)間免疫熒光染色檢測(cè)RanBP9表達(dá)情況 Bar=40 μm；與術(shù)后3 d比較：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

盡管有研究[5]表明在海馬組織中miR-101可以靶向結(jié)合RanBP9并調(diào)控其表達(dá)，但在生殖系統(tǒng)中，特別是男性睪丸中這種調(diào)控關(guān)系是否存在尚不能確定，因此進(jìn)行了小鼠精母細(xì)胞系(GC-2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，相較于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染miR-101 mimic后GC-2細(xì)胞中RanBP9表達(dá)量是下降的；相反，轉(zhuǎn)染miR-101 inhibitor后GC-2細(xì)胞中RanBP9的表達(dá)量是增加的。結(jié)果證實(shí)了miR-101和RanBP9在睪丸中也具有調(diào)控關(guān)系。在隱睪組織進(jìn)行qRT-PCR分析顯示，隱睪中miR-101表達(dá)量是增加的，而RanBP9的表達(dá)量是減少的，且它們的增加和減少的發(fā)生是同步的。這表明在體內(nèi)miR-101和RanBP9的調(diào)控關(guān)系也是存在的。

綜上所述，該研究通過外科手術(shù)構(gòu)建小鼠隱睪模型及一系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-101在體內(nèi)體外都參與調(diào)控RanBP9的表達(dá)，并首次證實(shí)了miR-101與隱睪癥的關(guān)系。但是該研究仍尚淺，miR-101和RanBP9在隱睪所致精子發(fā)生障礙中的具體機(jī)制目前仍不明確。及早的診斷與治療對(duì)于隱睪患者來說是非常重要的。該研究表明miR-101通過調(diào)控RanBP9的表達(dá)在隱睪所致男性不育中發(fā)揮著重要的作用，miR-101可以作為隱睪癥的一種生物學(xué)標(biāo)志物。