楊方方，劉 萍，程 靜，彭偲偲，雷 亮，吳 濤，宋紅萍,

肝細(xì)胞依靠細(xì)胞膜上的藥物轉(zhuǎn)運體實現(xiàn)攝取和分泌膽汁的功能。在病理狀態(tài)下，肝細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)運體發(fā)生顯著改變，參與誘導(dǎo)膽汁淤積性肝病發(fā)生[1]。膽管側(cè)膜ABC轉(zhuǎn)運體(ATP-binding cassette transporter，ABC transporter)表達(dá)異常、功能下降是膽汁淤積性肝病的重要分子基礎(chǔ)[2]。PDZK1(NHERF3)蛋白能夠調(diào)控多種藥物轉(zhuǎn)運體的表達(dá)和功能[3]。近年來發(fā)現(xiàn)，PDZK1表達(dá)抑制或者缺失，可以導(dǎo)致其靶蛋白(轉(zhuǎn)運體)的亞細(xì)胞定位異常、表達(dá)和功能下降。該研究篩選PDZK1基因的RNA最佳干擾靶點，構(gòu)建其慢病毒干擾載體LV3/PDZK1 shRNA，體外觀測慢病毒介導(dǎo)的shRNA對BRL-3A細(xì)胞PDZK1的沉默效應(yīng)及對膽管側(cè)膜膽鹽輸出泵(Bsep)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料BRL-3A細(xì)胞株購自ATCC；3個干擾靶點寡核苷酸序列及其對照序列的合成由武漢塞維爾生物提供；質(zhì)粒抽提試劑盒購自Roche公司；限制性內(nèi)切酶、DNA內(nèi)切酶、DNA連接酶和Taq聚合酶購自加拿大MBI Fermentas；中量抽提試劑盒購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；凝膠回收試劑盒購自北京天根生化公司；LV3 (H1/GFP&Puro)慢病毒載體購自上海吉瑪公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；PDZK1、Bsep抗體購自英國Abcam公司；最佳干擾靶點DNA oligo使用Designer 3.0(Genepharma)軟件進(jìn)行設(shè)計，合成引物由蘇州吉瑪基因提供。

1.2 方法

1.2.1PDZK1最佳siRNA靶點的設(shè)計與篩選 分別針對3個靶點設(shè)計干擾大鼠PDZK1的siRNA序列(914、797、1 075)；以5×104個細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種BRL-3A細(xì)胞在6孔板中，24 h后，分別以3對siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h后換液，48 h后采用RT-PCR和Western blot方法檢測PDZK1表達(dá)，篩選出最佳的RNA干擾靶點。大鼠PDZK1引物序列 F:5′-CTACGGTTTCTATCTGAGGGCG-3′，R:5′-AGGCAG TTCTTGACTTTGGCAG-3′；Bsep引物序列F:5′-CC CTCATACGGAATCCCAAGA-3′，R:5′-GGCGATGGG CAACTGAGAT-3′；β-actin引物序列F:5′-TGCTATG TTGCCCTAGACTTCG-3′，R:5′-GTTGGCATAGAGGTC TTTACGG-3′。

1.2.2PDZK1shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定 設(shè)計并合成針對最佳siRNA的shRNA靶序列；LV3-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號；正義鏈模板的5′端添加了GATCC，與BamH Ⅰ酶切后形成的粘端互補；反義鏈模板的5′端添加了AATTC，與EcoR Ⅰ酶切后形成的粘端互補。正義鏈：5′-GATCC-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(N18C)-TTTTTTG-3′；反義鏈：3′-G(CN18)-(AAGTTCTCT)-(N18G)-AAAAAACTTAA-5′；退火，將合成的DNA片段與帶有綠色熒光蛋白(GFP)的載體LV3 (H1/GFP&Puro)質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組慢病毒載體LV3/PDZK1 shRNA，隨即轉(zhuǎn)入感受態(tài)的大腸桿菌；將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到含Apm抗性LB瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)16 h，挑取陽性克隆抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切篩選，測序進(jìn)一步鑒定。測序正確的菌株采用高純度質(zhì)粒中量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。

1.2.3PDZK1 shRNA慢病毒包裝及滴度測定 測序通過的質(zhì)粒與pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T慢病毒包裝細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后收集293T細(xì)胞上清液，離心獲得病毒濃縮液，分裝后置-70 ℃冰箱中保存。采用倍比稀釋法測定重組慢病毒滴度。取對數(shù)生長期293T細(xì)胞，以2×103個細(xì)胞/孔接種至96孔板，分8組，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基100 μl，置37 ℃、5%CO2孵箱下培養(yǎng)24 h。準(zhǔn)備8個無菌的EP管，每管中加入90 μl的無血清培養(yǎng)基，取待測病毒原液10 μl加入第1個管中，混勻后，取10 μl加入第2個管中，以此操作直至最后一管。選取對應(yīng)細(xì)胞孔，棄掉90 μl培養(yǎng)基，加入90 μl稀釋好的病毒溶液，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。各組加入病毒原液相當(dāng)于10、1、10-1、10-2、10-3、10-4μl；24 h后補足完全培養(yǎng)基至200 μl；48～72 h后，觀察綠色熒光表達(dá)情況。病毒滴度為每孔GFP陽性細(xì)胞數(shù)/病毒原液量。

1.2.4BRL-3A細(xì)胞的LV3/PDZK1 shRNA重組慢病毒感染 轉(zhuǎn)染前1 d，取(2～3)×105個細(xì)胞/孔的BRL-3A細(xì)胞接種在6孔板上，培養(yǎng)24 h后將原有培養(yǎng)基棄去，加入2 ml的細(xì)胞完全培養(yǎng)基；置于5%CO2的培養(yǎng)箱中，于37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞匯合達(dá)到40%～60%；細(xì)胞換液，將病毒液與終濃度5 μg/ml polybrene加入新鮮培養(yǎng)基中，經(jīng)空病毒感染或未感染的BRL-3A細(xì)胞作為對照；8～12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞狀態(tài)無明顯病變，繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。BRL-3A細(xì)胞選用MOI=20進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染，病毒用量(μl)=(細(xì)胞數(shù)×MOI值/病毒原液滴度)×103；24～48 h觀察GFP的表達(dá)情況并拍照。

1.2.5LV3/PDZK1 shRNA慢病毒對BRL-3A細(xì)胞PDZK1和膽管側(cè)膜Bsep基因表達(dá)的影響 收集經(jīng)慢病毒感染48 h的BRL-3A細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR法檢測PDZK1、Bsep基因的mRNA表達(dá)水平，以空病毒感染的BRL-3A細(xì)胞的同樣檢測作為對照，以β-actin基因作為內(nèi)參。大鼠PDZK1、Bsep特異檢測引物見1.2.1。

1.2.6LV3/PDZK1 shRNA慢病毒對BRL-3A細(xì)胞PDZK1和膽管側(cè)膜Bsep蛋白表達(dá)的影響 采用Western blot法將經(jīng)慢病毒感染48 h的BRL-3A細(xì)胞總蛋白以及膜蛋白分別提取、轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，再浸于含PDZK1一抗(1 ∶500)與Bsep一抗(1 ∶500)的封閉液中，4 ℃過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶3 000)，室溫孵育0.5 h，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min；隨后與混合好的ECL溶液結(jié)合1～2 min，顯色拍照，以β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 PDZK1最佳siRNA靶點的篩選采用RT-PCR法和Western blot方法從3對siRNA中篩選出最佳RNA干擾序列(表1、圖1)，結(jié)果選定Pdzk1-rat-914對應(yīng)的序列進(jìn)行病毒包裝。

2.2 PDZK1 shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定重組慢病毒載體LV3/PDZK1 shRNA經(jīng)限制性酶切酶BamHⅠ與EcoRⅠ酶切，酶切結(jié)果表明，被EcoR Ⅰ切開的可能是陽性克隆(圖2)。將陽性克隆進(jìn)行測序鑒定證實，攜帶PDZK1 shRNA的重組慢病毒載體LV3/PDZK1 shRNA得以成功構(gòu)建。

表1 siRNA序列信息

圖1 BRL-3A細(xì)胞轉(zhuǎn)染PDZK1 siRNA進(jìn)行篩選

2.3 PDZK1 shRNA慢病毒重組體的包裝及其滴度測定Lipofectamine2000基因轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)LV3/PDZK1 shRNA慢病毒質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察，可見GFP強表達(dá)(圖3)。以倍比稀釋方法檢測其病毒滴度為: 1×109TU/ml。

2.4 BRL-3A細(xì)胞的LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染未經(jīng)LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染的BRL-3A細(xì)胞不表達(dá)GFP(圖3C)，經(jīng)LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染的BRL-3A細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察可見明顯GFP表達(dá)(圖3D)。

2.5 LV3/PDZK1 shRNA慢病毒對BRL-3A細(xì)胞的PDZK1、Bsep基因表達(dá)的影響提取未經(jīng)感染的BRL-3A細(xì)胞(blank)、空載病毒感染48 h的BRL-3A細(xì)胞(NC)、LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染48 h的BRL-3A細(xì)胞(shRNA)總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示shRNA組PDZK1、Bsep基因的mRNA相對表達(dá)水平為：(0.17±0.02)、(0.43±0.07)；NC組PDZK1、Bsep基因的mRNA相對表達(dá)水平為：(0.97±0.06)，(0.94±0.25)；與NC組比較，shRNA組PDZK1、Bsep基因的mRNA相對表達(dá)水平顯著抑制(P<0.01)，見圖4。由此提示，重組慢病毒LV3/PDZK1 shRNA能在mRNA水平有效沉默BRL-3A細(xì)胞的PDZK1、Bsep基因的表達(dá)。

2.6 LV3/PDZK1 shRNA慢病毒對BRL-3A細(xì)胞PDZK1及Bsep蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測blank、NC、shRNA這3個組BRL-3A細(xì)胞的PDZK1及Bsep蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示與blank組和NC組比較，shRNA組的PDZK1和Bsep蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)，見圖5。由此提示，在RNA水平沉默BRL-3A細(xì)胞PDZK1基因可有效抑制其PDZK1及Bsep蛋白表達(dá)。

圖2 PDZK1 shRNA慢病毒載體的構(gòu)建示意圖

圖3 LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染的細(xì)胞 ×100

圖4 BRL-3A細(xì)胞中PDZK1及Bsep基因表達(dá)

A：PDZK1基因表達(dá)情況；B：Bsep基因表達(dá)情況，以actin為內(nèi)參；與shRNA組比較：**P<0.01

圖5 BRL-3A細(xì)胞中PDZK1及Bsep蛋白表達(dá)

A：PDZK1蛋白表達(dá)情況；B：Bsep蛋白表達(dá)情況；與shRNA組比較：**P<0.01

3 討論

近年來，PDZK1對藥物轉(zhuǎn)運體的調(diào)控作用逐漸引起重視。PDZK1具有PDZ結(jié)構(gòu)域，可以特異性識別并結(jié)合轉(zhuǎn)運體C末端大約5個氨基酸長度的特定序列模塊的肽類(PDZ結(jié)合域)。PDZK1大量分布在肝、腎、小腸，與多數(shù)轉(zhuǎn)運體的分布一致。機體病理狀態(tài)通過誘導(dǎo)PDZK1表達(dá)改變，繼而引起某些轉(zhuǎn)運體表達(dá)和功能異常。例如慢性腎病(CKD)大鼠的腎臟上皮細(xì)胞和腸道上皮細(xì)胞PDZK1表達(dá)受到顯著抑制，導(dǎo)致轉(zhuǎn)運體(Mrp4和OCTN1)定位紊亂和功能下降。因此，PDZK1已被視為轉(zhuǎn)運體相關(guān)疾病的新的治療靶點[4]。

炎癥誘導(dǎo)肝細(xì)胞膽管側(cè)膜ABC轉(zhuǎn)運體的表達(dá)與功能改變，是造成膽汁生成和排泌受阻的直接原因[5]。α-萘異硫氰酸酯(ANIT)能夠誘導(dǎo)肝臟炎性細(xì)胞浸潤并且明顯影響肝臟轉(zhuǎn)運體(Bsep、NTCP)，促進(jìn)膽汁淤積形成[6]。內(nèi)毒素誘導(dǎo)膽汁淤積大鼠的膽管側(cè)膜Bsep表達(dá)下調(diào)亦與肝組織炎癥程度緊密相關(guān)[7]。然而，炎癥影響ABC轉(zhuǎn)運體的機制尚不清楚。有報道[8]發(fā)現(xiàn)炎癥因子能夠抑制PDZK1蛋白表達(dá)。最新研究[9]顯示炎癥性肝損傷能夠引起PDZK1、膽管側(cè)膜Bsep和Mrp2表達(dá)均顯著下調(diào)。上述研究提示炎癥很可能通過PDZK1這一中介對膽管側(cè)膜ABC轉(zhuǎn)運體實現(xiàn)調(diào)控。

因此，運用RNA干擾技術(shù)，針對大鼠PDZK1基因序列，設(shè)計與篩選出PDZK1基因的3個干擾靶點。從3個干擾靶點中篩選到PDZK1基因的最佳干擾靶點。設(shè)計并合成針對最佳干擾靶點的shRNA靶序列，連入LV3載體，成功構(gòu)建了LV3/PDZK1 shRNA慢病毒載體，實現(xiàn)了該慢病毒載體對大鼠BRL-3A肝細(xì)胞的有效感染。RT-PCR與Western blot檢測證實，LV3/PDZK1 shRNA慢病毒載體能夠介導(dǎo)PDZK1 shRNA有效沉默BRL-3A細(xì)胞的PDZK1表達(dá)，同時下調(diào)膽管側(cè)膜Bsep的表達(dá)，提示PDZK1 shRNA可能通過沉默BRL-3A細(xì)胞的PDZK1，使BRL-3A細(xì)胞膽管側(cè)膜Bsep表達(dá)減少。而PDZK1下調(diào)引起B(yǎng)sep表達(dá)降低的機制可能與Bsep定位紊亂和發(fā)生降解有關(guān)。文獻(xiàn)[10]報道，轉(zhuǎn)運體(Oap1a1)需要PDZK1協(xié)同招募驅(qū)動蛋白kinesin-1，才能正確地運輸至肝細(xì)胞膜；敲除PDZK1可導(dǎo)致Oap1a1堆積在細(xì)胞內(nèi)并大量降解。另一項研究[11]發(fā)現(xiàn)，人腎上皮HEK293細(xì)胞的PDZK1過表達(dá)能夠明顯上調(diào)轉(zhuǎn)運體(MRP4)表達(dá)水平，可能與PDZK1減少MRP4降解有關(guān)。綜上所述，PDZK1可能扮演著一個在細(xì)胞內(nèi)協(xié)助運輸轉(zhuǎn)運體分子至細(xì)胞頂側(cè)膜，并且使其穩(wěn)定表達(dá)的伴侶蛋白的角色。