楊方方，劉 萍，程 靜，彭偲偲，雷 亮，吳 濤，宋紅萍,

肝細(xì)胞依靠細(xì)胞膜上的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體實(shí)現(xiàn)攝取和分泌膽汁的功能。在病理狀態(tài)下，肝細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)生顯著改變，參與誘導(dǎo)膽汁淤積性肝病發(fā)生[1]。膽管側(cè)膜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體(ATP-binding cassette transporter，ABC transporter)表達(dá)異常、功能下降是膽汁淤積性肝病的重要分子基礎(chǔ)[2]。PDZK1(NHERF3)蛋白能夠調(diào)控多種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和功能[3]。近年來發(fā)現(xiàn)，PDZK1表達(dá)抑制或者缺失，可以導(dǎo)致其靶蛋白(轉(zhuǎn)運(yùn)體)的亞細(xì)胞定位異常、表達(dá)和功能下降。該研究篩選PDZK1基因的RNA最佳干擾靶點(diǎn)，構(gòu)建其慢病毒干擾載體LV3/PDZK1 shRNA，體外觀測慢病毒介導(dǎo)的shRNA對BRL-3A細(xì)胞PDZK1的沉默效應(yīng)及對膽管側(cè)膜膽鹽輸出泵(Bsep)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料BRL-3A細(xì)胞株購自ATCC；3個(gè)干擾靶點(diǎn)寡核苷酸序列及其對照序列的合成由武漢塞維爾生物提供；質(zhì)粒抽提試劑盒購自Roche公司；限制性內(nèi)切酶、DNA內(nèi)切酶、DNA連接酶和Taq聚合酶購自加拿大MBI Fermentas；中量抽提試劑盒購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；凝膠回收試劑盒購自北京天根生化公司；LV3 (H1/GFP&Puro)慢病毒載體購自上海吉瑪公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；PDZK1、Bsep抗體購自英國Abcam公司；最佳干擾靶點(diǎn)DNA oligo使用Designer 3.0(Genepharma)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，合成引物由蘇州吉瑪基因提供。

1.2 方法

1.2.1PDZK1最佳siRNA靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)與篩選 分別針對3個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)干擾大鼠PDZK1的siRNA序列(914、797、1 075)；以5×104個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種BRL-3A細(xì)胞在6孔板中，24 h后，分別以3對siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h后換液，48 h后采用RT-PCR和Western blot方法檢測PDZK1表達(dá)，篩選出最佳的RNA干擾靶點(diǎn)。大鼠PDZK1引物序列 F:5′-CTACGGTTTCTATCTGAGGGCG-3′，R:5′-AGGCAG TTCTTGACTTTGGCAG-3′；Bsep引物序列F:5′-CC CTCATACGGAATCCCAAGA-3′，R:5′-GGCGATGGG CAACTGAGAT-3′；β-actin引物序列F:5′-TGCTATG TTGCCCTAGACTTCG-3′，R:5′-GTTGGCATAGAGGTC TTTACGG-3′。

1.2.2PDZK1shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定 設(shè)計(jì)并合成針對最佳siRNA的shRNA靶序列；LV3-shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號；正義鏈模板的5′端添加了GATCC，與BamH Ⅰ酶切后形成的粘端互補(bǔ)；反義鏈模板的5′端添加了AATTC，與EcoR Ⅰ酶切后形成的粘端互補(bǔ)。正義鏈：5′-GATCC-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(N18C)-TTTTTTG-3′；反義鏈：3′-G(CN18)-(AAGTTCTCT)-(N18G)-AAAAAACTTAA-5′；退火，將合成的DNA片段與帶有綠色熒光蛋白(GFP)的載體LV3 (H1/GFP&Puro)質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組慢病毒載體LV3/PDZK1 shRNA，隨即轉(zhuǎn)入感受態(tài)的大腸桿菌；將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到含Apm抗性LB瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)16 h，挑取陽性克隆抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切篩選，測序進(jìn)一步鑒定。測序正確的菌株采用高純度質(zhì)粒中量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒。

1.2.3PDZK1 shRNA慢病毒包裝及滴度測定 測序通過的質(zhì)粒與pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T慢病毒包裝細(xì)胞，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后收集293T細(xì)胞上清液，離心獲得病毒濃縮液，分裝后置-70 ℃冰箱中保存。采用倍比稀釋法測定重組慢病毒滴度。取對數(shù)生長期293T細(xì)胞，以2×103個(gè)細(xì)胞/孔接種至96孔板，分8組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基100 μl，置37 ℃、5%CO2孵箱下培養(yǎng)24 h。準(zhǔn)備8個(gè)無菌的EP管，每管中加入90 μl的無血清培養(yǎng)基，取待測病毒原液10 μl加入第1個(gè)管中，混勻后，取10 μl加入第2個(gè)管中，以此操作直至最后一管。選取對應(yīng)細(xì)胞孔，棄掉90 μl培養(yǎng)基，加入90 μl稀釋好的病毒溶液，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。各組加入病毒原液相當(dāng)于10、1、10-1、10-2、10-3、10-4μl；24 h后補(bǔ)足完全培養(yǎng)基至200 μl；48～72 h后，觀察綠色熒光表達(dá)情況。病毒滴度為每孔GFP陽性細(xì)胞數(shù)/病毒原液量。

1.2.4BRL-3A細(xì)胞的LV3/PDZK1 shRNA重組慢病毒感染 轉(zhuǎn)染前1 d，取(2～3)×105個(gè)細(xì)胞/孔的BRL-3A細(xì)胞接種在6孔板上，培養(yǎng)24 h后將原有培養(yǎng)基棄去，加入2 ml的細(xì)胞完全培養(yǎng)基；置于5%CO2的培養(yǎng)箱中，于37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞匯合達(dá)到40%～60%；細(xì)胞換液，將病毒液與終濃度5 μg/ml polybrene加入新鮮培養(yǎng)基中，經(jīng)空病毒感染或未感染的BRL-3A細(xì)胞作為對照；8～12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，若細(xì)胞狀態(tài)無明顯病變，繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。BRL-3A細(xì)胞選用MOI=20進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染，病毒用量(μl)=(細(xì)胞數(shù)×MOI值/病毒原液滴度)×103；24～48 h觀察GFP的表達(dá)情況并拍照。

1.2.5LV3/PDZK1 shRNA慢病毒對BRL-3A細(xì)胞PDZK1和膽管側(cè)膜Bsep基因表達(dá)的影響 收集經(jīng)慢病毒感染48 h的BRL-3A細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR法檢測PDZK1、Bsep基因的mRNA表達(dá)水平，以空病毒感染的BRL-3A細(xì)胞的同樣檢測作為對照，以β-actin基因作為內(nèi)參。大鼠PDZK1、Bsep特異檢測引物見1.2.1。

1.2.6LV3/PDZK1 shRNA慢病毒對BRL-3A細(xì)胞PDZK1和膽管側(cè)膜Bsep蛋白表達(dá)的影響 采用Western blot法將經(jīng)慢病毒感染48 h的BRL-3A細(xì)胞總蛋白以及膜蛋白分別提取、轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，再浸于含PDZK1一抗(1 ∶500)與Bsep一抗(1 ∶500)的封閉液中，4 ℃過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶3 000)，室溫孵育0.5 h，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min；隨后與混合好的ECL溶液結(jié)合1～2 min，顯色拍照，以β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 PDZK1最佳siRNA靶點(diǎn)的篩選采用RT-PCR法和Western blot方法從3對siRNA中篩選出最佳RNA干擾序列(表1、圖1)，結(jié)果選定Pdzk1-rat-914對應(yīng)的序列進(jìn)行病毒包裝。

2.2 PDZK1 shRNA慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定重組慢病毒載體LV3/PDZK1 shRNA經(jīng)限制性酶切酶BamHⅠ與EcoRⅠ酶切，酶切結(jié)果表明，被EcoR Ⅰ切開的可能是陽性克隆(圖2)。將陽性克隆進(jìn)行測序鑒定證實(shí)，攜帶PDZK1 shRNA的重組慢病毒載體LV3/PDZK1 shRNA得以成功構(gòu)建。

表1 siRNA序列信息

圖1 BRL-3A細(xì)胞轉(zhuǎn)染PDZK1 siRNA進(jìn)行篩選

2.3 PDZK1 shRNA慢病毒重組體的包裝及其滴度測定Lipofectamine2000基因轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)LV3/PDZK1 shRNA慢病毒質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察，可見GFP強(qiáng)表達(dá)(圖3)。以倍比稀釋方法檢測其病毒滴度為: 1×109TU/ml。

2.4 BRL-3A細(xì)胞的LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染未經(jīng)LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染的BRL-3A細(xì)胞不表達(dá)GFP(圖3C)，經(jīng)LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染的BRL-3A細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察可見明顯GFP表達(dá)(圖3D)。

2.5 LV3/PDZK1 shRNA慢病毒對BRL-3A細(xì)胞的PDZK1、Bsep基因表達(dá)的影響提取未經(jīng)感染的BRL-3A細(xì)胞(blank)、空載病毒感染48 h的BRL-3A細(xì)胞(NC)、LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染48 h的BRL-3A細(xì)胞(shRNA)總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示shRNA組PDZK1、Bsep基因的mRNA相對表達(dá)水平為：(0.17±0.02)、(0.43±0.07)；NC組PDZK1、Bsep基因的mRNA相對表達(dá)水平為：(0.97±0.06)，(0.94±0.25)；與NC組比較，shRNA組PDZK1、Bsep基因的mRNA相對表達(dá)水平顯著抑制(P<0.01)，見圖4。由此提示，重組慢病毒LV3/PDZK1 shRNA能在mRNA水平有效沉默BRL-3A細(xì)胞的PDZK1、Bsep基因的表達(dá)。

2.6 LV3/PDZK1 shRNA慢病毒對BRL-3A細(xì)胞PDZK1及Bsep蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測blank、NC、shRNA這3個(gè)組BRL-3A細(xì)胞的PDZK1及Bsep蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示與blank組和NC組比較，shRNA組的PDZK1和Bsep蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)，見圖5。由此提示，在RNA水平沉默BRL-3A細(xì)胞PDZK1基因可有效抑制其PDZK1及Bsep蛋白表達(dá)。

圖2 PDZK1 shRNA慢病毒載體的構(gòu)建示意圖

圖3 LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染的細(xì)胞 ×100

圖4 BRL-3A細(xì)胞中PDZK1及Bsep基因表達(dá)

A：PDZK1基因表達(dá)情況；B：Bsep基因表達(dá)情況，以actin為內(nèi)參；與shRNA組比較：**P<0.01

圖5 BRL-3A細(xì)胞中PDZK1及Bsep蛋白表達(dá)

A：PDZK1蛋白表達(dá)情況；B：Bsep蛋白表達(dá)情況；與shRNA組比較：**P<0.01

3 討論

近年來，PDZK1對藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)控作用逐漸引起重視。PDZK1具有PDZ結(jié)構(gòu)域，可以特異性識別并結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體C末端大約5個(gè)氨基酸長度的特定序列模塊的肽類(PDZ結(jié)合域)。PDZK1大量分布在肝、腎、小腸，與多數(shù)轉(zhuǎn)運(yùn)體的分布一致。機(jī)體病理狀態(tài)通過誘導(dǎo)PDZK1表達(dá)改變，繼而引起某些轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)和功能異常。例如慢性腎病(CKD)大鼠的腎臟上皮細(xì)胞和腸道上皮細(xì)胞PDZK1表達(dá)受到顯著抑制，導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)體(Mrp4和OCTN1)定位紊亂和功能下降。因此，PDZK1已被視為轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)疾病的新的治療靶點(diǎn)[4]。

炎癥誘導(dǎo)肝細(xì)胞膽管側(cè)膜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)與功能改變，是造成膽汁生成和排泌受阻的直接原因[5]。α-萘異硫氰酸酯(ANIT)能夠誘導(dǎo)肝臟炎性細(xì)胞浸潤并且明顯影響肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)體(Bsep、NTCP)，促進(jìn)膽汁淤積形成[6]。內(nèi)毒素誘導(dǎo)膽汁淤積大鼠的膽管側(cè)膜Bsep表達(dá)下調(diào)亦與肝組織炎癥程度緊密相關(guān)[7]。然而，炎癥影響ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的機(jī)制尚不清楚。有報(bào)道[8]發(fā)現(xiàn)炎癥因子能夠抑制PDZK1蛋白表達(dá)。最新研究[9]顯示炎癥性肝損傷能夠引起PDZK1、膽管側(cè)膜Bsep和Mrp2表達(dá)均顯著下調(diào)。上述研究提示炎癥很可能通過PDZK1這一中介對膽管側(cè)膜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體實(shí)現(xiàn)調(diào)控。

因此，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)，針對大鼠PDZK1基因序列，設(shè)計(jì)與篩選出PDZK1基因的3個(gè)干擾靶點(diǎn)。從3個(gè)干擾靶點(diǎn)中篩選到PDZK1基因的最佳干擾靶點(diǎn)。設(shè)計(jì)并合成針對最佳干擾靶點(diǎn)的shRNA靶序列，連入LV3載體，成功構(gòu)建了LV3/PDZK1 shRNA慢病毒載體，實(shí)現(xiàn)了該慢病毒載體對大鼠BRL-3A肝細(xì)胞的有效感染。RT-PCR與Western blot檢測證實(shí)，LV3/PDZK1 shRNA慢病毒載體能夠介導(dǎo)PDZK1 shRNA有效沉默BRL-3A細(xì)胞的PDZK1表達(dá)，同時(shí)下調(diào)膽管側(cè)膜Bsep的表達(dá)，提示PDZK1 shRNA可能通過沉默BRL-3A細(xì)胞的PDZK1，使BRL-3A細(xì)胞膽管側(cè)膜Bsep表達(dá)減少。而PDZK1下調(diào)引起B(yǎng)sep表達(dá)降低的機(jī)制可能與Bsep定位紊亂和發(fā)生降解有關(guān)。文獻(xiàn)[10]報(bào)道，轉(zhuǎn)運(yùn)體(Oap1a1)需要PDZK1協(xié)同招募驅(qū)動蛋白kinesin-1，才能正確地運(yùn)輸至肝細(xì)胞膜；敲除PDZK1可導(dǎo)致Oap1a1堆積在細(xì)胞內(nèi)并大量降解。另一項(xiàng)研究[11]發(fā)現(xiàn)，人腎上皮HEK293細(xì)胞的PDZK1過表達(dá)能夠明顯上調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)體(MRP4)表達(dá)水平，可能與PDZK1減少M(fèi)RP4降解有關(guān)。綜上所述，PDZK1可能扮演著一個(gè)在細(xì)胞內(nèi)協(xié)助運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)體分子至細(xì)胞頂側(cè)膜，并且使其穩(wěn)定表達(dá)的伴侶蛋白的角色。