楊 南,丁 婕,閆原野,魯 理,董 凱
視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞死亡的方式有多種,本課題組在國際上首次發(fā)現(xiàn)光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡的形態(tài)學(xué)改變[1]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn),半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶抑制劑(carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-fluoromethylketone, z-VAD-FMK)不僅誘導(dǎo)光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡,同時(shí)還參與了自噬的激活[2]。另外,圓柱瘤基因(cylindromatosis,CYLD)干擾可以抑制視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞中的壞死性凋亡和凋亡[3],但是對(duì)壞死性凋亡中的自噬有無影響尚不清楚。另一方面,活性氧、Beclin1、雷帕霉素靶蛋白、磷酸肌醇三磷酸激酶、LC3-Ⅱ等多種蛋白質(zhì)和信號(hào)通路參與了自噬的發(fā)生[4]。Beclin1是早期自噬體形成的必需組分,與自噬體膜的形成有關(guān),并引導(dǎo)募集其他自噬相關(guān)蛋白定位于自噬體膜[5]。LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換是自噬體形成的標(biāo)志[6]。該研究探討CYLD干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜脫離中光感受器細(xì)胞壞死性凋亡伴發(fā)自噬有無影響,為視網(wǎng)膜脫離后的視功能恢復(fù)提供一定理論基礎(chǔ)和干預(yù)思路。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)健康雄性SD大鼠48只,體質(zhì)量260~280 g,由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院和上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院提供,大鼠在室溫18~25 ℃、濕度<60%環(huán)境下飼養(yǎng)。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1視網(wǎng)膜脫離動(dòng)物模型的建立 設(shè)計(jì)CYLD干擾靶序列為5′-GGTTGTACGGATGGAACTTTC-3′,根據(jù)靶序列構(gòu)建慢病毒載體,轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞[3]。慢病毒干擾3周后,大鼠分為正常對(duì)照組、未干預(yù)組、CYLD干預(yù)組、陰性干預(yù)組,每組12只大鼠,用于電鏡和Western blot檢測(cè)各6只。實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉,術(shù)前0.5%的托吡卡胺擴(kuò)瞳;左氧氟沙星滴眼液沖洗結(jié)膜囊(蘇州參天制藥有限公司),右眼注入透明質(zhì)酸鈉(1% 美國博士倫公司)50 μl于視網(wǎng)膜下建立網(wǎng)脫模型,網(wǎng)膜隆起范圍約1/3~1/2。結(jié)膜10-0縫線標(biāo)記脫離范圍,以便取材時(shí)定位[1-3]。在各實(shí)驗(yàn)組建立視網(wǎng)膜脫離模型的同時(shí),視網(wǎng)膜下注入z-VAD-FMK (300 μmol/L,美國Enzo公司)5 μl。實(shí)驗(yàn)組大鼠只在右眼建立模型,左眼不做處理做對(duì)照。
1.2.2電鏡檢測(cè) 建模第3天后,水合氯醛腹腔麻醉大鼠,摘取眼球,沿角鞏膜緣剪開,清除角膜、晶體及玻璃體,剩下的眼杯使用2.5%戊二醛固定12 h,取出視網(wǎng)膜并制成1 mm×3 mm大小條塊,用無水酒精脫水后用環(huán)氧樹脂對(duì)標(biāo)本包埋。做成超薄切片,枸櫞酸鉛和醋酸鈾雙染法染色[1]。切片的觀察和攝片是使用JEM-1230EX透射電鏡(日本電子公司),觀察光感受器細(xì)胞層的超微結(jié)構(gòu)改變。
確定光感受器位置,單個(gè)切片隨機(jī)選取觀察的光感受器細(xì)胞為200個(gè),確定光感受器細(xì)胞的死亡方式是通過視網(wǎng)膜脫離后第3天觀察其形態(tài)學(xué)改變。通常光感受器細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小和細(xì)胞核濃縮,細(xì)胞壞死的表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、溶解,細(xì)胞膜破裂、不完整[2,7]。
1.2.3Western blot 建模第3天取視網(wǎng)膜組織,用RIPA裂解液與1%的蛋白酶抑制劑充分裂解,組織勻漿、超聲、離心BCA行蛋白濃度檢測(cè)定量;取等量蛋白上樣后凝膠電泳(SDS-PAGE),初始65 V,當(dāng)?shù)鞍孜挥跐饪s膠、分離膠交界處,提升為125 V;冰上轉(zhuǎn)膜2 h,25 V;5%脫脂牛奶室溫封閉40 min;封閉后,膜與LC-3(1 ∶500)、Beclin-1(1 ∶1 000)、β-肌動(dòng)蛋白(1 ∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜。復(fù)溫后TBST緩沖液洗膜3次,用HRP標(biāo)記的二抗(在TBST中1 ∶5 000稀釋,圣克魯斯生物技術(shù))室溫孵育2 h,根據(jù)說明,通過化學(xué)發(fā)光劑ECL顯現(xiàn)條帶[2-3]。使用Bandscan 4.3軟件(加拿大Glyko公司)檢測(cè)電泳條帶的灰度值。LC3蛋白、Beclin-1蛋白與內(nèi)參照β-actin相比,作為其相對(duì)表達(dá)水平。
2.1 CYLD干擾對(duì)視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞的影響建立視網(wǎng)膜脫離模型3 d后,電鏡觀察發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞不僅出現(xiàn)凋亡和壞死,而且還可以觀察到壞死性凋亡的形態(tài)學(xué)改變,其與壞死細(xì)胞類似,但染色質(zhì)固縮邊聚,同時(shí)可以觀察到明顯的空泡樣改變和自噬泡。見圖1。CYLD干預(yù)組感光細(xì)胞壞死數(shù)明顯低于未干預(yù)組和陰性干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.19,P<0.05)。見圖2。
圖1 電鏡下光感受器細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn) ×4 000A:正常對(duì)照組;B: 未干預(yù)組;C:CYLD干預(yù)組;D:陰性干預(yù)組
圖2 電鏡下光感受器細(xì)胞壞死數(shù)與未干預(yù)組比較:*P<0.05;與陰性干預(yù)組比較:#P<0.05
2.2 CYLD干擾對(duì)LC3蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,CYLD干預(yù)組的LC3蛋白相對(duì)表達(dá)較未干預(yù)組和陰性干預(yù)組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1623.81,P<0.01)。見圖3。
圖3 Western blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜LC3蛋白表達(dá)與未干預(yù)組比較:**P<0.01;與陰性干預(yù)組比較:##P<0.01
2.3 CYLD干擾對(duì)Beclin-1蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,CYLD干預(yù)組的Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)較未干預(yù)組和陰性干預(yù)組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=121.37,P<0.01)。見圖4。
圖4 Western blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜Beclin-1蛋白表達(dá)與未干預(yù)組比較:**P<0.01;與陰性干預(yù)組比較:##P<0.01
本研究結(jié)果顯示,慢病毒載體進(jìn)行大鼠視網(wǎng)膜下注射3周后,建立視網(wǎng)膜脫離模型,網(wǎng)脫模型建立后3 d,取視網(wǎng)膜組織進(jìn)行電鏡檢測(cè),光感受器細(xì)胞的病理學(xué)形態(tài)改變不僅是凋亡和壞死,同時(shí)部分細(xì)胞也表現(xiàn)為染色質(zhì)固縮邊聚,同時(shí)可以觀察到明顯的空泡樣改變和自噬泡,符合壞死性凋亡伴自噬的表現(xiàn)[8]。LC3、Beclin-1蛋白參與實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡伴自噬的發(fā)生,CYLD干擾后,LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)明顯降低,表明光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡伴發(fā)的自噬受抑制,其機(jī)制可能是抑制了LC3和Beclin-1的活化。從而可以得出CYLD干擾后,不僅可以抑制光感受器細(xì)胞的壞死和凋亡,同時(shí)還可以抑制壞死性凋亡中自噬的發(fā)生。
早期研究[9]表明,使用zVAD(一種具有廣泛特異性的泛半胱天冬酶抑制劑)可以誘導(dǎo)L929細(xì)胞的自噬和死亡。這種細(xì)胞死亡過程需要絲氨酸蘇氨酸激酶1受體相互作用蛋白,提示自噬參與壞死性凋亡。有研究[10]已經(jīng)證明自噬和壞死都參與了海馬體的神經(jīng)損傷,而姜黃素確實(shí)通過多方面的機(jī)制對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞死亡有神經(jīng)保護(hù)作用。Degterev et al[11]發(fā)現(xiàn)在壞死性凋亡過程中,自噬也可以被激活,并且與微管相關(guān)蛋白LC-3I轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C-3II相關(guān)。Rosenbaum et al[12]在視網(wǎng)膜缺血模型中發(fā)現(xiàn),使用z-VAD-FMK預(yù)處理后,壞死抑制素-1不僅能抑制壞死,還能抑制自噬,改善功能結(jié)果。這進(jìn)一步驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,證實(shí)CYLD干擾后,不僅抑制視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞的壞死和凋亡,同時(shí)抑制了光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡伴發(fā)的自噬。
目前認(rèn)為自噬主要作為一種保護(hù)機(jī)制,可以防止細(xì)胞死亡,維持細(xì)胞完整性主要通過亞細(xì)胞碎片的清除和再生代謝前體[13]。在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中,需要誘導(dǎo)自噬依賴性壞死性凋亡,以克服糖皮質(zhì)激素的耐藥性[14]。Kim et al[15]發(fā)現(xiàn)在肺癌的研究中利用紫草素抑制自噬后發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡增加。相反,本課題組前期觀察結(jié)果表明,自噬標(biāo)志物L(fēng)C-3II的活化受壞死信號(hào)的控制,這表明自噬參與壞死也導(dǎo)致細(xì)胞損傷[2]。這些都表明自噬和壞死性凋亡有對(duì)應(yīng)關(guān)系,但是自噬是一個(gè)復(fù)雜的過程,在壞死性凋亡的過程中自噬是如何被激活的尚不清楚,因此在未來的研究中,有必要探索自噬和壞死性凋亡的聯(lián)系。
綜上所述,在小分子干擾RNA介導(dǎo)的CYLD干擾的大鼠實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜脫離模型中,通過抑制LC3和Beclin-1的活化,抑制光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡伴發(fā)的自噬。進(jìn)一步研究自噬、凋亡和壞死性凋亡之間的調(diào)控關(guān)系,為最大限度抑制細(xì)胞死亡,促進(jìn)細(xì)胞存活,保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞提供新的理論依據(jù)和治療思路是本課題后續(xù)研究方向。
安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2019年10期