楊 南，丁 婕，閆原野，魯 理，董 凱

視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞死亡的方式有多種，本課題組在國際上首次發(fā)現(xiàn)光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡的形態(tài)學(xué)改變[1]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶抑制劑(carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-fluoromethylketone， z-VAD-FMK)不僅誘導(dǎo)光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡，同時(shí)還參與了自噬的激活[2]。另外，圓柱瘤基因(cylindromatosis，CYLD)干擾可以抑制視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞中的壞死性凋亡和凋亡[3]，但是對(duì)壞死性凋亡中的自噬有無影響尚不清楚。另一方面，活性氧、Beclin1、雷帕霉素靶蛋白、磷酸肌醇三磷酸激酶、LC3-Ⅱ等多種蛋白質(zhì)和信號(hào)通路參與了自噬的發(fā)生[4]。Beclin1是早期自噬體形成的必需組分，與自噬體膜的形成有關(guān)，并引導(dǎo)募集其他自噬相關(guān)蛋白定位于自噬體膜[5]。LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換是自噬體形成的標(biāo)志[6]。該研究探討CYLD干擾對(duì)實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜脫離中光感受器細(xì)胞壞死性凋亡伴發(fā)自噬有無影響，為視網(wǎng)膜脫離后的視功能恢復(fù)提供一定理論基礎(chǔ)和干預(yù)思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量260～280 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院和上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院提供，大鼠在室溫18～25 ℃、濕度<60%環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1視網(wǎng)膜脫離動(dòng)物模型的建立 設(shè)計(jì)CYLD干擾靶序列為5′-GGTTGTACGGATGGAACTTTC-3′，根據(jù)靶序列構(gòu)建慢病毒載體，轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞[3]。慢病毒干擾3周后，大鼠分為正常對(duì)照組、未干預(yù)組、CYLD干預(yù)組、陰性干預(yù)組，每組12只大鼠，用于電鏡和Western blot檢測(cè)各6只。實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，術(shù)前0.5%的托吡卡胺擴(kuò)瞳；左氧氟沙星滴眼液沖洗結(jié)膜囊(蘇州參天制藥有限公司)，右眼注入透明質(zhì)酸鈉(1% 美國博士倫公司)50 μl于視網(wǎng)膜下建立網(wǎng)脫模型，網(wǎng)膜隆起范圍約1/3～1/2。結(jié)膜10-0縫線標(biāo)記脫離范圍，以便取材時(shí)定位[1-3]。在各實(shí)驗(yàn)組建立視網(wǎng)膜脫離模型的同時(shí)，視網(wǎng)膜下注入z-VAD-FMK (300 μmol/L，美國Enzo公司)5 μl。實(shí)驗(yàn)組大鼠只在右眼建立模型，左眼不做處理做對(duì)照。

1.2.2電鏡檢測(cè) 建模第3天后，水合氯醛腹腔麻醉大鼠，摘取眼球，沿角鞏膜緣剪開，清除角膜、晶體及玻璃體，剩下的眼杯使用2.5%戊二醛固定12 h，取出視網(wǎng)膜并制成1 mm×3 mm大小條塊，用無水酒精脫水后用環(huán)氧樹脂對(duì)標(biāo)本包埋。做成超薄切片，枸櫞酸鉛和醋酸鈾雙染法染色[1]。切片的觀察和攝片是使用JEM-1230EX透射電鏡(日本電子公司)，觀察光感受器細(xì)胞層的超微結(jié)構(gòu)改變。

確定光感受器位置，單個(gè)切片隨機(jī)選取觀察的光感受器細(xì)胞為200個(gè)，確定光感受器細(xì)胞的死亡方式是通過視網(wǎng)膜脫離后第3天觀察其形態(tài)學(xué)改變。通常光感受器細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小和細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞壞死的表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、溶解，細(xì)胞膜破裂、不完整[2,7]。

1.2.3Western blot 建模第3天取視網(wǎng)膜組織，用RIPA裂解液與1%的蛋白酶抑制劑充分裂解，組織勻漿、超聲、離心BCA行蛋白濃度檢測(cè)定量；取等量蛋白上樣后凝膠電泳(SDS-PAGE)，初始65 V，當(dāng)?shù)鞍孜挥跐饪s膠、分離膠交界處，提升為125 V；冰上轉(zhuǎn)膜2 h，25 V；5%脫脂牛奶室溫封閉40 min；封閉后，膜與LC-3(1 ∶500)、Beclin-1(1 ∶1 000)、β-肌動(dòng)蛋白(1 ∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜。復(fù)溫后TBST緩沖液洗膜3次，用HRP標(biāo)記的二抗(在TBST中1 ∶5 000稀釋，圣克魯斯生物技術(shù))室溫孵育2 h，根據(jù)說明，通過化學(xué)發(fā)光劑ECL顯現(xiàn)條帶[2-3]。使用Bandscan 4.3軟件(加拿大Glyko公司)檢測(cè)電泳條帶的灰度值。LC3蛋白、Beclin-1蛋白與內(nèi)參照β-actin相比，作為其相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 CYLD干擾對(duì)視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞的影響建立視網(wǎng)膜脫離模型3 d后，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞不僅出現(xiàn)凋亡和壞死，而且還可以觀察到壞死性凋亡的形態(tài)學(xué)改變，其與壞死細(xì)胞類似，但染色質(zhì)固縮邊聚，同時(shí)可以觀察到明顯的空泡樣改變和自噬泡。見圖1。CYLD干預(yù)組感光細(xì)胞壞死數(shù)明顯低于未干預(yù)組和陰性干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.19，P<0.05)。見圖2。

圖1 電鏡下光感受器細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn) ×4 000A：正常對(duì)照組；B： 未干預(yù)組；C：CYLD干預(yù)組；D：陰性干預(yù)組

圖2 電鏡下光感受器細(xì)胞壞死數(shù)與未干預(yù)組比較：*P<0.05；與陰性干預(yù)組比較：#P<0.05

2.2 CYLD干擾對(duì)LC3蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，CYLD干預(yù)組的LC3蛋白相對(duì)表達(dá)較未干預(yù)組和陰性干預(yù)組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1623.81，P<0.01)。見圖3。

圖3 Western blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜LC3蛋白表達(dá)與未干預(yù)組比較：**P<0.01；與陰性干預(yù)組比較：##P<0.01

2.3 CYLD干擾對(duì)Beclin-1蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，CYLD干預(yù)組的Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)較未干預(yù)組和陰性干預(yù)組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=121.37，P<0.01)。見圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜Beclin-1蛋白表達(dá)與未干預(yù)組比較：**P<0.01；與陰性干預(yù)組比較：##P<0.01

3 討論

本研究結(jié)果顯示，慢病毒載體進(jìn)行大鼠視網(wǎng)膜下注射3周后，建立視網(wǎng)膜脫離模型，網(wǎng)脫模型建立后3 d，取視網(wǎng)膜組織進(jìn)行電鏡檢測(cè)，光感受器細(xì)胞的病理學(xué)形態(tài)改變不僅是凋亡和壞死，同時(shí)部分細(xì)胞也表現(xiàn)為染色質(zhì)固縮邊聚，同時(shí)可以觀察到明顯的空泡樣改變和自噬泡，符合壞死性凋亡伴自噬的表現(xiàn)[8]。LC3、Beclin-1蛋白參與實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡伴自噬的發(fā)生，CYLD干擾后，LC3、Beclin-1蛋白表達(dá)明顯降低，表明光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡伴發(fā)的自噬受抑制，其機(jī)制可能是抑制了LC3和Beclin-1的活化。從而可以得出CYLD干擾后，不僅可以抑制光感受器細(xì)胞的壞死和凋亡，同時(shí)還可以抑制壞死性凋亡中自噬的發(fā)生。

早期研究[9]表明，使用zVAD(一種具有廣泛特異性的泛半胱天冬酶抑制劑)可以誘導(dǎo)L929細(xì)胞的自噬和死亡。這種細(xì)胞死亡過程需要絲氨酸蘇氨酸激酶1受體相互作用蛋白，提示自噬參與壞死性凋亡。有研究[10]已經(jīng)證明自噬和壞死都參與了海馬體的神經(jīng)損傷，而姜黃素確實(shí)通過多方面的機(jī)制對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞死亡有神經(jīng)保護(hù)作用。Degterev et al[11]發(fā)現(xiàn)在壞死性凋亡過程中，自噬也可以被激活，并且與微管相關(guān)蛋白LC-3I轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C-3II相關(guān)。Rosenbaum et al[12]在視網(wǎng)膜缺血模型中發(fā)現(xiàn)，使用z-VAD-FMK預(yù)處理后，壞死抑制素-1不僅能抑制壞死，還能抑制自噬，改善功能結(jié)果。這進(jìn)一步驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)CYLD干擾后，不僅抑制視網(wǎng)膜脫離后光感受器細(xì)胞的壞死和凋亡，同時(shí)抑制了光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡伴發(fā)的自噬。

目前認(rèn)為自噬主要作為一種保護(hù)機(jī)制，可以防止細(xì)胞死亡，維持細(xì)胞完整性主要通過亞細(xì)胞碎片的清除和再生代謝前體[13]。在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中，需要誘導(dǎo)自噬依賴性壞死性凋亡，以克服糖皮質(zhì)激素的耐藥性[14]。Kim et al[15]發(fā)現(xiàn)在肺癌的研究中利用紫草素抑制自噬后發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡增加。相反，本課題組前期觀察結(jié)果表明，自噬標(biāo)志物L(fēng)C-3II的活化受壞死信號(hào)的控制，這表明自噬參與壞死也導(dǎo)致細(xì)胞損傷[2]。這些都表明自噬和壞死性凋亡有對(duì)應(yīng)關(guān)系，但是自噬是一個(gè)復(fù)雜的過程，在壞死性凋亡的過程中自噬是如何被激活的尚不清楚，因此在未來的研究中，有必要探索自噬和壞死性凋亡的聯(lián)系。

綜上所述，在小分子干擾RNA介導(dǎo)的CYLD干擾的大鼠實(shí)驗(yàn)性視網(wǎng)膜脫離模型中，通過抑制LC3和Beclin-1的活化，抑制光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡伴發(fā)的自噬。進(jìn)一步研究自噬、凋亡和壞死性凋亡之間的調(diào)控關(guān)系，為最大限度抑制細(xì)胞死亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，保護(hù)視網(wǎng)膜細(xì)胞提供新的理論依據(jù)和治療思路是本課題后續(xù)研究方向。