何 葉，潘林鑫，張 永，范禮斌，劉曉穎

遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良基因(spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDL)編碼的Sedlin蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間體(ER-golgi intermediate compartment, ERGIC)囊泡運(yùn)輸中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1-2]。分析X-連鎖遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT)病例，結(jié)果顯示患者SEDL發(fā)生多種突變，導(dǎo)致Sedlin蛋白定位異常，且Sedlin蛋白羧基端的完整有利于其在ERGIC的定位，突變最終導(dǎo)致軟骨發(fā)育功能異常[3-4]。

最普遍的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活力及功能的方式是蛋白質(zhì)磷酸化，酪氨酸位點(diǎn)的磷酸化除了在變構(gòu)及激活該蛋白的活力外，更重要的是促進(jìn)其和結(jié)合蛋白相互作用而形成多蛋白復(fù)合體[5]。本實(shí)驗(yàn)室前期已證實(shí)Sedlin與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(RB1)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在相互作用[6]，該研究旨在探討Sedlin的C端缺失及磷酸化位點(diǎn)突變是否影響Sedlin的亞細(xì)胞定位及其與RB1的共定位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞、質(zhì)粒和菌株 本實(shí)驗(yàn)所用的COS7細(xì)胞、HEK 293T細(xì)胞，載體pCDGFP、pGEX-3X，Sedlin相關(guān)質(zhì)粒，TG1、BL21、DH5α菌株等均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑 PrimeSTAR酶(日本TaKaRa公司)；BamH I、EcoR I限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Dpn I酶；DMEM高糖培養(yǎng)基(北京賽默飛世爾科技有限公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(美國(guó)OMEGA公司)；胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；Lipofectamine 2000、Opti-MEM(美國(guó)Invitrogen公司)；GFP抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；FLAG抗體(美國(guó)Sigma公司)；細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；SuperSignal West Pico顯色試劑盒(美國(guó)Pierce公司)；IPTG、PMSF、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；谷胱甘肽瓊脂糖球珠(美國(guó)GE Healthcare公司)；熒光封片膠(丹麥DAKO公司)；熒光顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss Jena公司)。

1.2 方法

1.2.1Sedlin缺失突變體和點(diǎn)突變體的序列擴(kuò)增[6]以Sedlin全長(zhǎng)cDNA序列為模板，25 μl PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增：模板DNA 10 ng(0.5 μl)，上下游引物濃度均為20 pmol/μl(0.5 μl)，Prime STAR酶12.5 μl，ddH2O 11 μl。

1.2.2Sedlin缺失突變體的構(gòu)建[6]對(duì)上述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，凝膠試劑盒進(jìn)行回收，將得到的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I進(jìn)行雙酶切，并同樣雙酶切pCDGFP載體、pGEX-3X載體，將酶切后的產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接(16 ℃ 連接約12 h)，然后轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)胞并平板培養(yǎng)； 10 h后選取單克隆挑菌，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h進(jìn)行質(zhì)粒抽提，最后用BamH I和EcoR I進(jìn)行酶切鑒定；選酶切鑒定正確的質(zhì)粒送公司測(cè)序。

1.2.3Sedlin點(diǎn)突變體的構(gòu)建[6]20 μl擴(kuò)增產(chǎn)物加入Dpn I酶1.5 μl，37 ℃ 水浴2 h，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，平板培養(yǎng)約12～16 h后，挑取單克隆37 ℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)；最后抽提質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定，選取酶切鑒定正確的質(zhì)粒送公司測(cè)序。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含有100 U/ml青、鏈霉素及5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)COS7細(xì)胞、HEK 293T細(xì)胞。細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)傳代，次日將重組質(zhì)粒(μg) ∶Lipofectamine 2000按1 ∶2的比例轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞，用于檢測(cè)蛋白表達(dá)；將重組質(zhì)粒(μg)：Lipofectamine 2000按1 ∶1.5轉(zhuǎn)染至COS7細(xì)胞，用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

1.2.5GST-SedlinN、GST-Sedlin-Y115A、GST-Sedlin-Y115F融合蛋白的表達(dá)及純化 把pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆至含有氨芐抗性的2 ml LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)12 h；取50 μl菌液到含有氨芐抗性5 ml LB中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600值達(dá)0.4～0.6范圍時(shí)再按照GST-Sedlin融合蛋白的最佳誘導(dǎo)條件摸索制備GST-SedlinN、GST-Sedlin-Y115A、GST-Sedlin-Y115F的誘導(dǎo)條件，按照最佳條件誘導(dǎo)(pGEX-3X-SedlinN為0.05 mmol/L的IPTG,16 ℃誘導(dǎo)12 h，pGEX-3X-Sedlin-Y115A、pGEX-3X-Sedlin-Y115F為0.01 mmol/L的IPTG，30 ℃ 誘導(dǎo)4 h)，誘導(dǎo)結(jié)束后收集細(xì)菌并用含終濃度0.1 mmol/L的PMSF和DTT的細(xì)菌裂解液裂解約30 min，再適當(dāng)超聲以促進(jìn)細(xì)胞裂解；4 ℃ 、14 000 r/min離心20 min，取上清液，每管1 ml分裝至1.5 ml EP管，保存于-80 ℃。取1份制備好的融合蛋白用谷胱甘肽瓊脂糖球珠對(duì)其進(jìn)行純化并制成樣品，SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后凝膠成像儀拍照，檢測(cè)融合蛋白是否成功誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.6Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，加適量細(xì)胞裂解液，4 ℃ 孵育25～30 min，4 ℃ 、14 000 r/min離心20 min，取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳；100 V電轉(zhuǎn)1 h；PVDF膜于5%脫脂奶粉中封閉1.5 h，TBST洗膜(10 min、3次)，GFP兔抗(1 ∶1 000)4 ℃ 孵育過(guò)夜，TBST洗膜(10 min、3次)，二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜(10 min、3次)，ECL顯影。

1.2.7免疫熒光實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后約24 h取出COS7細(xì)胞爬片，用PBS清洗細(xì)胞(5 min、3次)，-20 ℃的甲醇固定5 min，再用70%乙醇溶液固定細(xì)胞5 min，PBS清洗(5 min、3次)；1%脫脂奶粉封閉30 min，F(xiàn)LAG一抗室溫孵育2 h，TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG孵育1 h；DAPI染核2 min，PBS清洗細(xì)胞(5 min、3次)，DAKO封片膠封片；熒光顯微鏡下觀察、拍攝。

2 結(jié)果

2.1 Sedlin突變體重組質(zhì)粒的酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果分別對(duì)重組質(zhì)粒pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F和pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F進(jìn)行雙酶切(BamH I、EcoR I)，結(jié)果見(jiàn)圖1A、1B。各重組質(zhì)粒均被切成兩條帶，一條帶與載體大小一致(A載體為pGEX-3X，約4 900 bp；B載體為pCDGFP，約6 100 bp)，另一條帶與目的片段大小一致(SedlinN為330 bp，Sedlin-Y115A/Y115F為420 bp)。上述質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)，證實(shí)各質(zhì)粒成功構(gòu)建，見(jiàn)圖1C、1D。

2.2 Sedlin突變體在原核細(xì)胞中的表達(dá)分別轉(zhuǎn)化pGEX-3X-SedlinN/Y115A/Y115F質(zhì)粒至BL21菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，收集菌體進(jìn)行裂解，經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖珠子純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示，純化后的樣品分別在約37 ku(圖2A)和40 ku(圖2B)的位置出現(xiàn)很強(qiáng)的蛋白條帶，大小符合GST-SedlinN、GST-Sedlin-Y115A、GST-Sedlin-Y115F融合蛋白，表明融合蛋白表達(dá)成功。

2.3 Sedlin突變體在HEK 293T細(xì)胞中的表達(dá)轉(zhuǎn)染后約48 h，收集細(xì)胞并進(jìn)行裂解，將細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F的細(xì)胞裂解液均能檢測(cè)到條帶，與預(yù)染的蛋白Marker對(duì)比，過(guò)表達(dá)的pCDGFP-SedlinN分子量為39 ku，點(diǎn)突變體pCDGFP-Sedlin-Y115A、pCDGFP-Sedlin-Y115F的分子量約為42 ku，與野生型pCDGFP-Sedlin的分子量一致，表明Sedlin突變體在HEK 293T細(xì)胞中正常表達(dá)。見(jiàn)圖3。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果圖

A、B：重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖；C、D：重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果圖；M1：Lambda DNA/EcoR I+HindⅢ Marker；M2：TaKaKa DL2000 Marker；1：pGEX-Sedlin的酶切鑒定結(jié)果；2：pGEX-SedlinN的酶切鑒定結(jié)果及測(cè)序圖；3：pGEX-Sedlin-Y115A的酶切鑒定結(jié)果及測(cè)序圖；4：pGEX-Sedlin-Y115F的酶切鑒定結(jié)果及測(cè)序圖；5：pCDGFP-Sedlin的酶切鑒定結(jié)果；6：pCDGFP-SedlinN的酶切鑒定結(jié)果及測(cè)序圖；7：pCDGFP-Sedlin-Y115A的酶切鑒定結(jié)果及測(cè)序圖；8：pCDGFP-Sedlin-Y115F的酶切鑒定結(jié)果及測(cè)序圖

圖2 考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)谷胱甘肽瓊脂糖球珠純化后的融合蛋白

M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker梯度；1：GST的細(xì)菌裂解液；2：GST-SedlinN的細(xì)菌裂解液；3：GST的純化蛋白；4：GST-SedlinN的純化蛋白；5：GST-Sedlin-Y115A的細(xì)菌裂解液；6：GST-Sedlin-Y115F的細(xì)菌裂解液；7：GST-Sedlin-Y115A的純化蛋白；8：GST-Sedlin-Y115F的純化蛋白

圖3 Sedlin突變體蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)

1：轉(zhuǎn)染pCDGFP-Sedlin的HEK 293T細(xì)胞裂解液；2：轉(zhuǎn)染pCDGFP-SedlinN的HEK 293T細(xì)胞裂解液；3：轉(zhuǎn)染pCDGFP-Sedlin-Y115A的HEK 293T細(xì)胞裂解液；4：轉(zhuǎn)染pCDGFP-Sedlin-Y115F的HEK 293T細(xì)胞裂解液

2.4 Sedlin突變體蛋白在COS7細(xì)胞中的定位分別單轉(zhuǎn)Sedlin突變體pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F至COS7細(xì)胞中，然后進(jìn)行免疫熒光制片、顯微拍攝，結(jié)果顯示它們?cè)诩?xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，且細(xì)胞核表達(dá)量較高，見(jiàn)圖4A，這一結(jié)果與野生型Sedlin的定位基本一致，見(jiàn)圖4B。表明Sedlin的C端缺失后，以及C端磷酸化位點(diǎn)突變后并未影響其亞細(xì)胞定位。

2.5 Sedlin突變體蛋白與RB1蛋白的共定位分別共轉(zhuǎn)Sedlin突變體質(zhì)粒pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F與pcDNA3.1-FLAG-RB1至COS7細(xì)胞中，進(jìn)行免疫熒光制片、顯微拍攝，結(jié)果顯示它們與RB1蛋白在核內(nèi)均存在明顯的共定位，表明Sedlin的C端缺失后，以及C端磷酸化位點(diǎn)突變后并未影響其與RB1的共定位(圖5A、5B)，提示Sedlin的N端可能是與RB1相互結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)域。

3 討論

SEDT是一種軟骨發(fā)育功能障礙疾病，病變主要累及身體承重大關(guān)節(jié)，以退行性大關(guān)節(jié)炎和短軀干性侏儒為主要臨床表現(xiàn)[1]。SEDT為X-連鎖隱性遺傳，具有高度遺傳性[7]。高度保守的Sedlin蛋白，在心臟、腎臟、骨骼肌等組織中均有分布。相關(guān)定位研究[8]表明Sedlin蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞COS7中與ERGIC在細(xì)胞核周?chē)胁糠止捕ㄎ滑F(xiàn)象。現(xiàn)階段研究普遍認(rèn)為SEDT的發(fā)病原因可能是SEDL基因突變導(dǎo)致Sedlin功能異常，軟骨細(xì)胞不能正常分泌細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而引起骨骼發(fā)育異常。SEDT相關(guān)的Sedlin突變不會(huì)導(dǎo)致亞細(xì)胞定位的異常，但涉及疏水核心內(nèi)殘基的突變會(huì)導(dǎo)致其與轉(zhuǎn)錄因子MBP1、PITX1和SF1相互作用的喪失[9]。Sedlin的二聚化及其核定位表明哺乳動(dòng)物Sedlin的其他作用；據(jù)報(bào)道其與酵母中的Sedlin同源物Trs20p已經(jīng)作為T(mén)RAPP復(fù)合物中的單體存在[10]，其中Sedlin在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體的膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。人Rb1基因全長(zhǎng)178 143 bp，定位于染色體13q14，編碼約104～110 ku的核內(nèi)磷酸化蛋白pRb[11]。RB1蛋白幾乎在所有正常細(xì)胞中表達(dá)，但表達(dá)量存在組織和發(fā)育階段的差異，在視網(wǎng)膜、心臟和肌肉中較高，肝臟、胸腺和腦中較低，且隨年齡的增長(zhǎng)，表達(dá)量在各組織中均有顯著下降。RB1蛋白具有包括參與細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡的調(diào)控等功能，RB1的抑癌作用與這些功能的正常發(fā)揮密不可分[12]。

圖4 Sedlin及其突變體蛋白在COS7細(xì)胞中的定位

A：Sedlin突變體蛋白(SedlinN/Y115A/Y115F)在COS7細(xì)胞中的定位；B：Sedlin蛋白在COS7細(xì)胞中的定位；GFP：顯示含GFP標(biāo)簽的蛋白；DAPI：顯示染色的細(xì)胞核；Merge：疊加效果

圖5 Sedlin突變體蛋白與RB1蛋白在COS7細(xì)胞中的共定位

A：Sedlin突變體蛋白(SedlinN/Y115A/Y115F)與RB1蛋白在COS7細(xì)胞中的共定位；B：Sedlin蛋白與RB1蛋白在COS7細(xì)胞中的共定位；TRITC:含F(xiàn)LAG標(biāo)簽的RB1蛋白；GFP：顯示含GFP標(biāo)簽的蛋白；DAPI：顯示染色的細(xì)胞核；Merge：疊加效果

本研究通過(guò)構(gòu)建pCDGFP-SedlinN、pCDGFP-Sedlin-Y115A、pCDGFP-Sedlin-Y115F真核表達(dá)質(zhì)粒，并將其分別轉(zhuǎn)染至COS7、HEK 293T細(xì)胞，比較 Sedlin突變體相對(duì)于野生型在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位改變。鑒于本課題組前期已證實(shí)野生型Sedlin蛋白與RB1蛋白存在共定位，所以又分別將上述幾個(gè)質(zhì)粒與FLAG-RB1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至COS7細(xì)胞中，了解Sedlin突變體蛋白與RB1蛋白的共定位情況。將Sedlin的三個(gè)突變體構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-3X中，誘導(dǎo)表達(dá)GST融合蛋白，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)融合蛋白表達(dá)情況。

構(gòu)建的兩個(gè)點(diǎn)突變體在DNA水平條帶大小相對(duì)于野生型而言無(wú)明顯變化，只是DNA序列中對(duì)應(yīng)位置堿基種類發(fā)生變化，而總的堿基數(shù)不變，除了Tyr115Phe、Tyr115Ala突變體以外，常見(jiàn)的Sedlin突變體還有Asp47Tyr、Ser73Leu、Phe83Ser和Val130Asp，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[9]中對(duì)Sedlin三維結(jié)構(gòu)分析得知，Sedlin突變體(Ser73Leu、Phe83Ser、Val130Asp)位于Sedlin的疏水核心結(jié)構(gòu)域內(nèi)，因此可能會(huì)影響 Sedlin的結(jié)構(gòu)完整性以及與其他蛋白的相互作用。例如，極性Ser73到Leu73的突變將導(dǎo)致疏水性溝槽的破壞從而導(dǎo)致氫鍵的損失。類似地，Phe83和Val130殘基處于疏水區(qū)域內(nèi)蛋白質(zhì)的內(nèi)部，這些非極性殘基突變?yōu)闃O性殘基(分別為絲氨酸和天冬氨酸)可能會(huì)破壞疏水核心內(nèi)的相互作用，導(dǎo)致Sedlin的錯(cuò)誤折疊，這將破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[9]。

pCDGFP-SedlinN、pCDGFP-Sedlin-Y115A、pCDGFP-Sedlin-Y115F幾個(gè)突變體在HEK 293T細(xì)胞里均有表達(dá)，且缺失突變體的蛋白分子量低于野生型及其點(diǎn)突變體，但是分子量變化不大，這是因?yàn)镾EDL基因的編碼區(qū)423 bp，而編碼Sedlin的缺失突變體(N端)的基因有339 bp，結(jié)果證明缺失了Sedlin的C端以后Sedlin的缺失突變體(N端)依然能正常表達(dá)。免疫熒光結(jié)果顯示突變體pCDGFP-SedlinN/Y115A/Y115F在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均有表達(dá)，與野生型Sedlin的定位情況基本一致，表明上述突變均不會(huì)改變Sedlin蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)合本文中上述免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明的RB1蛋白與SedlinN/Y115A/Y115F突變體蛋白在COS7中均存在共定位，說(shuō)明Sedlin的第115位氨基酸(磷酸化位點(diǎn))突變后(Tyr115Phe、Tyr115Ala)并不會(huì)導(dǎo)致其與RB1蛋白共定位的改變；同時(shí)由于RB1蛋白與SedlinN蛋白存在共定位情況，可以得出初步結(jié)論：Sedlin蛋白與RB1蛋白相互作用的部位可能是Sedlin蛋白的N端。

本研究重點(diǎn)關(guān)注Sedlin的3個(gè)突變體蛋白的表達(dá)及其與RB1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況，將為本課題組后續(xù)研究Sedlin與RB1相互作用的詳細(xì)機(jī)制提供依據(jù)，為進(jìn)一步揭示人類Sedlin蛋白在細(xì)胞中的作用機(jī)制、與相關(guān)疾病的關(guān)系等奠定一定的基礎(chǔ)。