包莉莉，楊波，王冬雪，程立立

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八零醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，石家莊 050000)

在IVF/ICSI促排卵方案中，GnRH-a長方案因?yàn)槟軌蛴行б种圃绨l(fā)LH峰，避免因自發(fā)排卵導(dǎo)致的周期取消，多年來一直是促排卵的主流方案。也因?yàn)殚L方案對垂體降調(diào)節(jié)導(dǎo)致的內(nèi)源性LH抑制，同時(shí)在促排卵過程中大量FSH的添加，使得FSH與LH的比值與自然周期中二者比值極為不同，而這一變化對卵母細(xì)胞質(zhì)量產(chǎn)生怎樣的影響尚未可知。隨著人們認(rèn)知的不斷深入，很多學(xué)者認(rèn)為LH的添加能夠使得長方案中激素的變化更趨近自然從而改善卵子質(zhì)量及妊娠結(jié)局[1]。臨床上應(yīng)用最多的尿源性人絕經(jīng)期促性腺激素(HMG)，存在以下缺點(diǎn)：LH活性水平不穩(wěn)定，含有無效成分，不同藥品批次間存在差異，及過敏反應(yīng)等。而r-LH因?yàn)閮r(jià)格昂貴，半衰期短，在國內(nèi)一直沒能成為取代HMG的主流用藥。高純度HMG(HP-HMG)含有75 U 的FSH，以及9.9 U HCG和0.4 U LH共同驅(qū)動(dòng)達(dá)到75 U的LH活性。1 U HCG 相當(dāng)于6～7 U LH活性，且HCG的半衰期為31 h，長于LH的13 h[2]，并以其純度高、穩(wěn)定性好、副反應(yīng)小的優(yōu)勢已逐漸替代尿源性HMG在臨床中的應(yīng)用。雖然LH的添加在長方案促排卵過程中已經(jīng)達(dá)到專家的共識，但何時(shí)添加LH可以最大程度發(fā)揮LH在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中的作用、改善卵母細(xì)胞以提高臨床妊娠率，成為近年來臨床醫(yī)生所關(guān)心的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)就長方案促排卵過程中HP-HMG不同的添加時(shí)機(jī)對鮮胚移植周期中各項(xiàng)指標(biāo)的影響做了對比分析。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析于2016年1月至2017年12月在我院生殖中心應(yīng)用黃體期GnRH-a長方案促排卵方案進(jìn)行IVF/ICSI -ET治療的卵巢儲備功能正常的424例不孕患者病例資料。不孕病因包括盆腔輸卵管因素、排卵障礙、男方因素、不明原因等。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡20～36歲；(2)雙側(cè)卵巢基礎(chǔ)竇卵泡總數(shù)8～20個(gè)；(3)基礎(chǔ)FSH<10 U/L；(4)基礎(chǔ)E2<183.5 pmol/L；(5)月經(jīng)周期介于25至35 d之間。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重原發(fā)性疾病及生殖器異常；(2)自身免疫系統(tǒng)疾?。?3)子宮平滑肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥等疾??；(4)內(nèi)分泌代謝性疾??；(5)PCOS；(6)既往IVF/ICSI治療史。

二、研究方法

1.分組：424例患者根據(jù)HP-HMG不同的添加時(shí)機(jī)分為兩組：全程添加HP-HMG為A組(n=141)；中卵泡期添加HP-HMG為B組(n=283)。

2.黃體期GnRH-a長方案促排卵方案：從前次月經(jīng)周期排卵后的第7天開始每日給予達(dá)菲林(注射用醋酸曲普瑞林，益普生，法國)0.1 mg，皮下注射18 d左右，監(jiān)測各項(xiàng)激素包括雌二醇(E2)、孕酮(P)、LH的變化，同時(shí)陰道超聲監(jiān)測竇卵泡直徑、子宮內(nèi)膜厚度，達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)(E2<183.5 pmol/L，LH<1.0 U/L，子宮內(nèi)膜厚度<5 mm)后啟動(dòng)促性腺激素(Gn)，達(dá)菲林劑量改為每日0.05 mg至HCG日。

促排卵用藥A組給予rFSH(果納芬，雪蘭諾，瑞士)75～150 U+HP-HMG(輝凌，德國)75 U促排卵啟動(dòng)，B組給予rFSH 150～225 U促排卵啟動(dòng)。當(dāng)陰道超聲顯示雙側(cè)卵巢出現(xiàn)卵泡直徑大于12 mm的卵泡時(shí)添加HP-HMG 75 U。當(dāng)陰道超聲顯示雙側(cè)卵巢直徑18 mm以上的卵泡數(shù)占直徑14 mm以上的卵泡數(shù)的60%以上、直徑14 mm以上卵泡的E2平均值為734～1101 pmol/L時(shí)，當(dāng)日晚給予注射用重組人HCG(艾澤，雪蘭諾，德國)250 μg皮下注射，35～36 h后取卵。

3.胚胎移植及黃體支持：目前我中心鮮胚移植均為D3卵裂胚，即取卵后72 h對于符合新鮮周期移植標(biāo)準(zhǔn)的患者進(jìn)行卵裂胚移植，剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)形成囊胚后采用玻璃化冷凍的方法進(jìn)行保存。鮮胚移植標(biāo)準(zhǔn)：取卵數(shù)<20枚，P<4.75 nmol/L，取卵后3 d超聲顯示雙側(cè)卵巢直徑不超過8 cm，內(nèi)膜厚度>8 mm，且患者無不適癥狀。自取卵日即每天肌注黃體酮注射液20 mg、口服地屈孕酮20 mg 2次/日支持黃體功能，

4.妊娠判斷：移植后14 d檢測血清β-HCG水平，如HCG>10 U/L繼續(xù)黃體支持，待移植后28 d進(jìn)行陰道超聲檢查，觀察孕囊個(gè)數(shù)，著床部位、胚芽、原始心管搏動(dòng)，見孕囊者確定為臨床妊娠。

5.觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn)：Gn天數(shù)、Gn量；HCG日LH、 E2及P水平；HCG日子宮內(nèi)膜厚度；平均獲卵數(shù)；MⅡ卵數(shù)，MⅡ卵率(MⅡ卵數(shù)/總獲卵數(shù)×100%)；正常受精率(雙原核受精卵數(shù)/MⅡ卵數(shù)×100%)；優(yōu)質(zhì)胚胎率(優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/雙原核受精卵數(shù)×100%)；鮮胚移植率(移植周期數(shù)/取卵周期數(shù)×100%)；臨床妊娠率(臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%)；流產(chǎn)率(流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%)；種植率(著床胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%)；高反應(yīng)發(fā)生率(>15個(gè)獲卵的周期數(shù)/取卵周期數(shù)×100%)；孕酮升高率(HCG日孕酮≥4.75 nmol/L的周期數(shù)/取卵周期數(shù)×100%)；OHSS發(fā)生率(發(fā)生中重度OHSS例數(shù)/取卵周期數(shù)×100%)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、兩組患者一般情況比較

兩組患者平均年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)、基礎(chǔ)激素水平及不孕因素所占比例均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

二、兩組患者的促排卵臨床數(shù)據(jù)

兩組患者的Gn用量及Gn天數(shù)、注射HCG日E2水平及子宮內(nèi)膜厚度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HCG日P水平A組顯著低于B組(P<0.05)(表2)。

三、兩組患者IVF實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)及妊娠結(jié)局比較

A組的獲卵數(shù)、流產(chǎn)率、高反應(yīng)發(fā)生率略差于B組，而正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、種植率均優(yōu)于B組，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；A組鮮胚移植率顯著高于B組(P<0.05)；A組中無人發(fā)生孕酮水平升高及中重度OHSS，而B組中分別有38人和9人發(fā)生孕酮水平升高和中重度OHSS，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ；兩組患者的流產(chǎn)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

表1 兩組患者基本情況比較[(-±s)，n(%)]

表2 兩組患者的促排卵臨床數(shù)據(jù)(-±s)

注：與A組比較，*P<0.05

表3 兩組患者IVF實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)及妊娠結(jié)局 [(-±s)，n(%)]

注：與A組比較，*P<0.05

討論

在自然周期中早卵泡期雖然卵泡顆粒細(xì)胞表面沒有LH受體，但卵泡膜細(xì)胞表面已經(jīng)存在著LH受體，也就是說在卵泡直徑<10 mm的時(shí)候，LH在卵泡內(nèi)的含量雖低，卻有著不可或缺的作用，將毛細(xì)血管中的膽固醇轉(zhuǎn)化為雄激素，為顆粒細(xì)胞在FSH作用下合成雌激素提供底物，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖[3]。而經(jīng)典的GnRH-a長方案在對垂體進(jìn)行降調(diào)節(jié)，在避免產(chǎn)生早發(fā)LH峰的同時(shí)，也使得整個(gè)促排卵過程中LH水平過低，使得在促排卵過程的后期LH的不足導(dǎo)致代謝合成途徑從Δ5途徑向Δ4途徑轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致孕酮合成的增加，使得子宮內(nèi)膜提前轉(zhuǎn)化，胚胎著床的窗口期過早關(guān)閉，臨床妊娠率明顯下降[4]。因此，在長方案促排卵過程中及時(shí)補(bǔ)充LH，以期能夠促進(jìn)卵泡的成熟和降低孕酮水平，這已經(jīng)成為生殖醫(yī)生的共識[5-6]，但由于促排卵方案多元化，添加時(shí)機(jī)的選擇仍然存在爭議，馬亞蘭等[7]認(rèn)為在拮抗劑方案中對于卵巢儲備功能正常的患者，在中晚卵泡期添加HP-HMG的患者比全程添加的患者成熟卵率、優(yōu)胚率及臨床妊娠率更高。而本實(shí)驗(yàn)中兩組長方案均添加HP-HMG，根據(jù)添加時(shí)機(jī)不同進(jìn)行分組，詳細(xì)比較了兩組之間促排卵的各項(xiàng)指標(biāo)，全程添加HP-HMG組可以有效降低孕酮升高導(dǎo)致的鮮胚周期的取消率，且大大降低OHSS發(fā)生率。

本實(shí)驗(yàn)中兩組黃體期GnRH-a長方案促排卵方案均添加HP-HMG，僅僅因?yàn)闀r(shí)機(jī)不同使得孕酮水平產(chǎn)生差異，與王鳳等[8]在改良超長方案中得到的結(jié)論相同。分析原因可能全程添加組HP-HMG通過含有9.9 U的HCG發(fā)揮LH的生物學(xué)活性，在卵泡發(fā)育的早期就能結(jié)合膜細(xì)胞LH受體，將孕酮順利轉(zhuǎn)化為雄激素，進(jìn)而生成雌激素，避免了因?yàn)樵型^早升高所導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜提前轉(zhuǎn)化，種植窗提前關(guān)閉；同時(shí)可能由于HCG的半衰期長，在連續(xù)使用6 d時(shí)HCG的血藥濃度可達(dá)到最大濃度且保持穩(wěn)定，而Gn 6 d時(shí)卵泡正處于中卵泡期，LH的需求逐漸增高，此時(shí)發(fā)揮LH的最大生物學(xué)效應(yīng)，能夠有效地避免因?yàn)長H不足導(dǎo)致的孕酮升高。而半程添加組在中卵泡期才開始添加HP-HMG，因?yàn)槭褂脮r(shí)間短，使得HCG的疊加作用未得到充分利用，因此仍會(huì)有孕酮合成的增多。本研究發(fā)現(xiàn)，全程添加組不僅孕酮水平明顯低于半程添加組(1.97 nmol/L vs.3.33 nmol/L)，而且因孕酮升高取消移植率也明顯低于半程添加組(0 vs.13.42%)，與Andersen等[9]進(jìn)行的全球多中心隨機(jī)對照研究結(jié)論一致。

全程添加組的獲卵數(shù)略低于半程添加組，可能是由于早卵泡期卵泡在全程添加組HP-HMG中FSH和LH協(xié)同作用下共同發(fā)育，減少了優(yōu)勢卵泡的募集[10]。并且隨著使用時(shí)間的延長，HCG作用的累加，在中卵泡期LH水平達(dá)到一個(gè)相對穩(wěn)定的濃度，使得優(yōu)勢卵泡進(jìn)一步發(fā)育成熟，同時(shí)抑制中小卵泡生長，使其閉鎖，使得獲卵數(shù)降低，從而有效地減少OHSS發(fā)生率[11]。本研究中全程添加組的高反應(yīng)率略低于半程添加組，考慮因?yàn)闃颖玖可俚脑颍玂HSS發(fā)生率明顯低于半程添加組(0 vs.3.18%)。

基于較低的孕酮水平以及較少的獲卵數(shù)這兩個(gè)明顯的優(yōu)勢，使得全程添加組的鮮胚移植率明顯高于半程添加組(70.92% vs.51.24%，P<0.05)，且臨床妊娠率略高于半程添加組(74.00% vs.63.44%)，雖然差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究結(jié)果與其他學(xué)者認(rèn)為通過HP-HMG的持續(xù)添加，血清中HCG水平與優(yōu)胚率及活產(chǎn)率成正相關(guān)[12]結(jié)論一致。

HP-HMG的全程使用使得全程添加組中LH水平在Gn 6 d時(shí)達(dá)到一個(gè)相對穩(wěn)定的濃度[13]，使得FSH/LH的比值更接近于自然周期，而全程添加組的優(yōu)胚率較半程添加組有增高的趨勢，雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能因?yàn)闃颖玖可俚脑颉Ｗ訉m內(nèi)膜同樣存在LH受體[14]，可能通過作用于胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1(IGFBP-1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)刺激子宮內(nèi)膜血管生成和內(nèi)膜生長，從而改善子宮內(nèi)膜血運(yùn)及容受性[4]。

目前關(guān)于凍融胚胎移植的利弊認(rèn)識尚未統(tǒng)一。除PCOS患者凍融胚胎移植能夠明顯提高活產(chǎn)率[15]外，凍融胚胎移植相對于鮮胚移植不僅在胚胎處理上多了冷凍/復(fù)蘇步驟，胚胎接觸了更多的化學(xué)試劑，增大了變異及損傷的可能性；另一方面，也增加了患者的花費(fèi)以及等待的時(shí)間。在我國目前試管嬰兒完全自費(fèi)的情況下，如果在安全且臨床妊娠率得到保證的情況下，鮮胚移植無疑有著更大的優(yōu)勢。而本實(shí)驗(yàn)中的全程添加組由于HP-HMG的全程使用，不僅有效地降低了OHSS發(fā)生率，而且有效地避免因孕酮升高導(dǎo)致的新鮮周期取消，且臨床妊娠率也有升高趨勢，值得進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量在臨床推廣。