連若純，余姝毅，王曉暉，陳現(xiàn)，許健，李玉葉，劉冬思，曾勇

(深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045)

抗磷脂綜合征(antiphospholipid antibody syndrome，APS)是一組與抗磷脂抗體(antiphospholipid antibody，APA)有關(guān)的自身免疫性疾病，主要臨床表現(xiàn)為動脈、靜脈血栓形成和病理妊娠(如妊娠早期流產(chǎn)、中晚期死胎等)以及血小板減少等[1]。主要的抗磷脂抗體包括抗β2糖蛋白1抗體(抗β2-GP1抗體)、抗心磷脂抗體(anticaridiolipin antibody，aCL)、狼瘡抗凝物(lupus anticoagulant，LA)。目前針對APS的治療主要是運用常規(guī)抗凝藥物如低劑量阿司匹林、普通肝素及低分子肝素等，然而仍有20%～30%的APS患者治療失敗[2]。如何改善這些患者的妊娠結(jié)局，成為目前亟需解決難題之一。

硫酸羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)是4-氨基喹啉類抗瘧藥，20世紀50年代隨著抗瘧藥在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)和類風濕性關(guān)節(jié)炎治療中的應(yīng)用，HCQ用于風濕性疾病治療的療效得到肯定，并且應(yīng)用越來越廣泛。進一步研究揭示HCQ具有免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)代謝、抗腫瘤等作用，同時具有抗血栓形成的重要作用[3]。第13屆APS國際研討會中提出APS患者合并血栓病史或SLE，建議給予HCQ輔助治療[4]。那么經(jīng)過常規(guī)抗凝治療后再次妊娠失敗的APS患者，聯(lián)合HCQ治療效果如何呢？目前鮮有關(guān)于HCQ聯(lián)合抗凝藥物治療難治性APS患者的報道，因此本研究擬探討HCQ聯(lián)合抗凝治療對APS患者妊娠結(jié)局的影響及相關(guān)機制。

資料與方法

一、研究對象

收集在2011年1月至2016年12月于深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖免疫診療中心就診查尿HCG陽性且診斷符合悉尼標準[1]的APS患者109例。納入標準：(1)年齡≤38歲；(2)符合以下任意一項臨床標準：≥1次孕10周及以上不能解釋的形態(tài)學(xué)正常的死胎；≥1次孕34周以內(nèi)形態(tài)正常的早產(chǎn)兒；3次以上孕10周以內(nèi)不能解釋的自發(fā)性流產(chǎn)；(3)符合以下任意一項實驗室標準：抗β2-GP1抗體IgM和/或IgG連續(xù)2次間隔12周以上檢測陽性；aCL-IgM和/或IgG連續(xù)2次間隔12周以上檢測陽性；LA連續(xù)2次間隔12周以上檢測陽性；(4)常規(guī)抗凝治療：低劑量阿司匹林聯(lián)合低分子肝素治療后再次出現(xiàn)自然流產(chǎn)患者；(5)無炎癥系統(tǒng)性損傷，如出現(xiàn)全身臟器損傷的SLE、自身免疫性肝病、腎間質(zhì)性病變等。排除標準：(1)治療后因?qū)m頸機能不全、胎兒畸形或染色體異常等導(dǎo)致的流產(chǎn)；(2)過敏體質(zhì)；(3)眼底病變；(4)伴有心、腦、腎等重要器官病變。

根據(jù)不同治療方案，分為HCQ組(48例)和對照組(61例)。HCQ組予HCQ聯(lián)合抗凝藥物治療，對照組只接受抗凝藥物治療。

二、研究方法

1.APA檢測方法：運用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)，采用德國歐蒙試劑盒定量檢測血清中aCL-IgG、aCL-IgM、抗β2-GP1抗體IgG、抗β2-GP1抗體IgM、抗Annexin V抗體的表達。陽性判斷標準：aCL-IgG>20 GPL，aCL-IgM>20 MPL，抗β2-GP1抗體IgG>20 U/ml，抗β2-GP1抗體IgM>20 U/ml，Annexin V>25 U/ml。

2.APA檢測時機：(1)孕前2次檢測間隔6周；(2)驗孕日。

3.治療方法：對照組孕前1個月開始給予阿司匹林腸溶片50 mg，每日1次，排卵后或胚胎移植前一周低分子肝素鈉或低分子肝素鈣4 000～6 000 IU，每日2次。HCQ組在對照組治療方案基礎(chǔ)上，孕前1個月服用HCQ(賽能，賽諾菲，法國) 200 mg，每日2次。停藥時機：(1)連續(xù)復(fù)查2次以上APA均陰性，可逐漸停抗凝藥物及HCQ；(2)出現(xiàn)副反應(yīng)時停藥。

4.凍融胚胎移植內(nèi)膜準備方案：激素替代周期，月經(jīng)第3天開始服用戊酸雌二醇(補佳樂，拜耳，德國)4 mg/d，每5天遞增2 mg至第18天，第19天添加黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)60 mg/d，第22天移植卵裂期胚胎或第24天移植囊胚。

三、觀察指標

兩組孕前第2次檢測與驗孕日aCL-IgM/IgG、抗β2-GP1抗體IgM/IgG及抗Annexin V抗體滴度水平；早期流產(chǎn)率、妊娠滿3個月繼續(xù)妊娠率、胚胎種植率、活嬰出生率；不良反應(yīng)發(fā)生情況。

早期流產(chǎn)率=妊娠<12周自然流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；妊娠滿3個月繼續(xù)妊娠率=妊娠≥12周周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；胚胎種植率=超聲下可見孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；活嬰出生率=活嬰出生數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

一、HCQ組與對照組患者基本情況

兩組患者平均年齡、基礎(chǔ)FSH水平、既往流產(chǎn)次數(shù)、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)及囊胚占比均無顯著差異(P>0.05)。HCQ組33例，對照組37例進行凍融胚胎移植后妊娠，其余患者自然妊娠(表1)。

表1 HCQ組與對照組患者基本情況及相關(guān)指標的比較[(-±s)，%]

二、HCQ聯(lián)合抗凝藥物治療前后APA滴度變化情況

分別記錄孕前第二次檢測與驗孕日復(fù)查APA滴度的情況，HCQ患者兩次檢測期間均使用HCQ治療。與治療前比較，HCQ組治療后抗β2-GP1抗體IgG、aCL-IgM、aCL-IgG滴度均有顯著降低(P<0.05)，抗Annexin V抗體及抗β2-GP1抗體IgM滴度雖然下降，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖1)。

三、HCQ組與對照組治療后驗孕日APA抗體滴度水平比較情況

與對照組比較，驗孕日HCQ組抗β2-GP1抗體IgG、aCL-IgG及抗Annexin V抗體平均滴度較對照組低，而aCL-IgM及抗β2-GP1抗體IgM滴度較對照組高，但均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖2)。

四、HCQ聯(lián)合抗凝藥物治療后妊娠結(jié)局情況比較

對所有研究對象的妊娠結(jié)局進行隨訪，HCQ組48例、對照組59例獲得臨床妊娠，對照組2例生化妊娠。臨床妊娠中，HCQ組有2例雙胎妊娠，對照組有7例雙胎妊娠。HCQ組妊娠滿3個月繼續(xù)妊娠率高于對照組(85.4% vs.72.9%)，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。HCQ組早期流產(chǎn)率顯著低于對照組(P<0.05)。HCQ組的活嬰出生率高于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

五、HCQ聯(lián)合抗凝藥物治療后副作用情況分析

HCQ組48例患者平均服用HCQ時間為(7.47±3.45)月，其中3例患者出現(xiàn)眼睛干澀不適癥狀，發(fā)生率為6.3%(3/48)。43例出生嬰兒隨訪1年，結(jié)果顯示均未發(fā)現(xiàn)任何先天性缺陷。

A：抗Annexin V抗體；B：aCL-IgG；C：aCL-IgM；D：抗β2-GP1抗體IgG；E：抗β2-GP1抗體IgM；前后比較，*P<0.05，**P<0.01

A：抗Annexin V抗體；B：aCL-IgG；C：aCL-IgM；D：抗β2-GP1抗體IgG；E：抗β2-GP1抗體IgM

表2 HCQ組與對照組患者治療后妊娠結(jié)局情況比較(%)

討論

APS是指APA陽性合并有動靜脈血栓形成和/或病理妊娠的一組臨床征象的總稱，其中血栓形成是APS的主要病理基礎(chǔ)，也是造成病理妊娠的重要因素，其致病性抗體為APA。婦產(chǎn)科APS主要發(fā)病機制可能為：(1)APA可誘導(dǎo)胎盤血栓形成、破壞膜聯(lián)蛋白A5在胎盤局部形成的保護膜；(2)APA可與蛻膜細胞結(jié)合而誘導(dǎo)胎盤局部產(chǎn)生炎癥；(3)APA可與滋養(yǎng)細胞結(jié)合抑制滋養(yǎng)層細胞增殖和分化，從而誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞凋亡[5-7]。針對APS導(dǎo)致的不良妊娠結(jié)局，臨床上主要通過運用抗凝藥物如低分子肝素、小劑量阿司匹林進行預(yù)防和治療，數(shù)據(jù)提示約70%患者保胎成功，然而仍有部分APS患者再次出現(xiàn)妊娠失敗[8-9]。

研究表明，HCQ可有效改善SLE和類風濕性關(guān)節(jié)炎等風濕免疫疾病病情，安全有效且耐受性良好，可用于妊娠婦女，與其他抗風濕藥物聯(lián)合應(yīng)用可進一步提高療效[10-11]。在國內(nèi)外臨床研究中HCQ也逐步被運用在APS治療中并取得較好療效，為這部分難治性APS患者帶來了福音。報道顯示HCQ在APS治療中的主要作用機制是：抑制β2-GP1與磷脂層結(jié)合而抑制其復(fù)合物形成，抑制GPⅡb/Ⅲa通路阻斷血小板聚集和黏附，破壞磷脂層表面Annexin V保護膜等，從而抑制血栓形成[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)HCQ聯(lián)合抗凝治療后aCL抗體IgM/IgG及抗β2-GP1抗體IgG滴度均較治療前顯著降低(P<0.05)，而抗Annexin V抗體及抗β2-GP1抗體IgM滴度無顯著變化，提示HCQ可通過降低aCL-IgG、抗β2-GP1抗體IgG滴度來有效緩解APS。同時數(shù)據(jù)進一步顯示，與單純服用常規(guī)抗凝藥物相比，HCQ聯(lián)合常規(guī)抗凝藥物治療后，aCL抗體IgG、抗β2-GP1抗體IgG滴度及抗Annexin V抗體滴度均呈降低趨勢。研究結(jié)果提示HCQ聯(lián)合抗凝治療比常規(guī)抗凝藥物治療可以更有效降低APA的滴度。

2015年歐洲一項多中心回顧性研究結(jié)果顯示HCQ聯(lián)合低分子肝素、小劑量阿司匹林等抗凝治療后，可顯著降低早期流產(chǎn)率，提高活嬰出生率(P均<0.05)[15]。Sciascia等[16]的一項回顧性研究同樣發(fā)現(xiàn)，HCQ輔助治療組較單純低分子肝素聯(lián)合阿司匹林抗凝治療組的活嬰出生率顯著提高，并能顯著降低病理妊娠的發(fā)生(P均<0.05)。我們的研究數(shù)據(jù)表明與單純使用阿司匹林和低分子肝素相比，HCQ聯(lián)合阿司匹林和低分子肝素的患者臨床妊娠率及3個月繼續(xù)妊娠率有升高趨勢，而早期流產(chǎn)率顯著降低，與國外研究結(jié)果一致。提示HCQ聯(lián)合抗凝藥物治療對降低難治性APS患者早期流產(chǎn)率有一定的療效。Rand等[14]研究顯示，HCQ可顯著降低抗β2-GP1抗體IgG、aCL抗體IgG，抑制APA與β2-GP1復(fù)合物形成，從而發(fā)揮抗血栓形成作用。另外，HCQ還可能抑制GPⅡb/Ⅲa通路阻斷血小板聚集和黏附，從而改善局部血液循環(huán)，降低早期流產(chǎn)風險。本研究結(jié)果顯示，HCQ治療后aCL抗體IgG、抗β2-GP1抗體IgG滴度及抗Annexin V抗體滴度亦有降低趨勢，但無顯著差異(P>0.05)。因此，HCQ是否通過降低APA滴度改善難治性APS患者妊娠結(jié)局，仍須擴大樣本量進一步研究。

另外，HCQ在妊娠期使用的安全性亦是臨床醫(yī)生甚為關(guān)注的問題。HCQ主要的不良反應(yīng)是眼底視網(wǎng)膜損害，此損害一般是不可逆的。但該不良反應(yīng)出現(xiàn)與用藥劑量及用藥時間有關(guān)，且發(fā)生概率較低。故用藥前需先排除眼底疾病，一旦發(fā)現(xiàn)眼睛不適，立即停藥。HCQ在FDA評級屬C類藥物，可少量通過胎盤和乳汁，但歐洲風濕病防治聯(lián)合會指出HCQ在妊娠期間及哺乳期均可安全使用，不影響胎兒及新生兒發(fā)育[17-18]。國內(nèi)外多項研究表明，妊娠期間使用HCQ，胎兒出生后并未增加先天性畸形、視網(wǎng)膜病變等，妊娠期使用安全[11，18-19]。本研究中使用HCQ患者中有3例出現(xiàn)眼睛干澀不適癥狀，停藥后癥狀緩解。43名活嬰出生時均未發(fā)現(xiàn)先天性缺陷，隨訪1年亦未發(fā)現(xiàn)任何后遺癥。

綜上所述，HCQ聯(lián)合常規(guī)抗凝治療可改善難治性APS患者的妊娠結(jié)局，有效降低早期流產(chǎn)率，且HCQ毒副作用較小，耐受性較好，目前沒有證據(jù)提示HCQ對胎兒存在不良影響。故對于常規(guī)抗凝治療效果不佳的患者，可聯(lián)合使用HCQ。其主要機制可能是通過降A(chǔ)PA的滴度，抑制β2-GP1與磷脂雙分子層結(jié)合從而使其不能發(fā)揮作用，或抑制GPⅡb/Ⅲa通路阻斷血小板聚集和黏附，從而改善胎盤局部血液循環(huán)。但其對難治性APS妊娠結(jié)局的療效評估、作用機制及安全性問題仍須進一步研究。