陳磊，季悅，王珊珊，姜偉華，王沛青

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京 210008)

隨著輔助生殖技術(shù)的飛速發(fā)展，多胎妊娠率也逐年增高，從而導(dǎo)致母嬰并發(fā)癥也越來越多[1-2]。單胚胎移植作為降低多胎妊娠的有效手段之一，得到人們?cè)絹碓蕉嗟闹匾?。相?duì)于雙胚胎移植而言，要保證較好的妊娠結(jié)局，單胚胎移植對(duì)移植胚胎的質(zhì)量要求更高。目前移植胚胎的選擇依據(jù)仍然主要是形態(tài)學(xué)觀察指標(biāo)，卵裂球數(shù)目能夠有效的反映胚胎的發(fā)育速度，可以預(yù)測(cè)胚胎活力與妊娠結(jié)局。根據(jù)Istanbul共識(shí)，Day 2卵裂球數(shù)目為4細(xì)胞，Day 3卵裂球數(shù)目為8細(xì)胞的胚胎具有較高的著床能力[3]。同時(shí)Magli等[4]研究指出，Day 3的8細(xì)胞階段的胚胎是理想的移植胚胎。然而，臨床上有較多患者會(huì)獲得發(fā)育較快的Day 3受精胚胎(>8細(xì)胞)，這類胚胎移植的妊娠結(jié)局狀況鮮有研究報(bào)道。

本研究將應(yīng)用時(shí)差成像系統(tǒng)(Time-Lapse imaging，TLI)培養(yǎng)技術(shù)，基于卵裂模式與時(shí)間參數(shù)分層篩選模型優(yōu)選胚胎進(jìn)行移植，回顧性分析了胚胎發(fā)育速度單因素對(duì)單胎妊娠結(jié)局的影響，探討具有較快卵裂率的胚胎的發(fā)育潛力和應(yīng)用前景。

資料與方法

一、研究對(duì)象

對(duì)2014年4月至2017年5月在南京鼓樓醫(yī)院生殖中心行常規(guī)體外受精(IVF)單分裂胚移植的患者資料進(jìn)行回顧性分析。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)因盆腔輸卵管因素行IVF助孕；(2)常規(guī)IVF周期；(3)獲卵數(shù)為5～15枚；(4)月經(jīng)第3日FSH<12 U/L；(5)女方年齡<40歲；(6)周期數(shù)<2個(gè)；(7)常規(guī)促排卵方案[5]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)PGS/PGD周期；(2)供卵周期；(3)男性因素不育；(4)移植日內(nèi)膜<8 mm。

根據(jù)第3天移植胚胎的卵裂球數(shù)目分為8～9細(xì)胞組(n=168)、10～11細(xì)胞組(n=36)、12～16細(xì)胞組(n=30)，且10～11細(xì)胞組、12～16細(xì)胞組中均無符合優(yōu)質(zhì)胚胎篩選條件的8～9細(xì)胞胚胎。

二、研究方法

1.TLI系統(tǒng)：本研究所采用的時(shí)差成像系統(tǒng)是Primo Vision TLI(Vitrolife，瑞典)[6]，它是將培養(yǎng)箱與胚胎倒置顯微鏡相結(jié)合，通過數(shù)據(jù)線將胚胎發(fā)育過程中所采集到的圖片傳輸?shù)脚囵B(yǎng)箱外的顯示器上，拍照頻率為5 min/次，能夠有效地監(jiān)測(cè)胚胎發(fā)育的整個(gè)過程。此培養(yǎng)系統(tǒng)有自己專用的集合培養(yǎng)皿(WOW)，WOW是一種9孔培養(yǎng)皿，每個(gè)孔都有自己獨(dú)立的數(shù)字編號(hào)，便于胚胎學(xué)家區(qū)分。

2.配子的采集與胚胎培養(yǎng)：采用常規(guī)促排卵方案，B超監(jiān)測(cè)卵泡生長(zhǎng)，待主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)到18～20 mm后注射HCG(珠海麗珠制藥)，36 h后行陰道B超引導(dǎo)下卵泡穿刺取卵術(shù)。獲卵3 h后，采用短時(shí)受精法，將采集到的人卵母細(xì)胞與精子按1∶10 000的比例混合加入IVF(Vitrolife，瑞典)微滴中，共同孵育5 h后機(jī)械剝除顆粒細(xì)胞，通過觀察第二極體是否釋放來判斷受精情況，之后將受精卵轉(zhuǎn)移至含有G1(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)液的WOW集合培養(yǎng)皿中，置于Primo Vision TLI系統(tǒng)培養(yǎng)觀察到第3 d進(jìn)行移植。

3.胚胎評(píng)估：根據(jù)Istanbul共識(shí)對(duì)分裂期胚胎質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分。以授精時(shí)間為起點(diǎn)，通過時(shí)差成像系統(tǒng)記錄胚胎發(fā)育過程中的卵裂模式與時(shí)間參數(shù)，采用本中心建立的胚胎篩選模型進(jìn)行胚胎篩選[7]。移植胚胎篩選范圍是：卵裂模式為正常、不均或非軸性卵裂，且時(shí)間參數(shù)符合s2<0.50 h (s2=t4-t3，即停留在3細(xì)胞階段時(shí)間)、t5<48.93 h (5細(xì)胞分裂時(shí)間)。如該患者無符合上述篩選條件的胚胎，則不納入本研究范圍。

4.移植與妊娠結(jié)局判定：?jiǎn)闻咛ヒ浦仓芷谥?，在TLI系統(tǒng)中培養(yǎng)到第3天，優(yōu)先移植符合篩選條件的8細(xì)胞胚胎，若無則選取符合篩選條件的卵裂速度較快的胚胎(≥9個(gè)細(xì)胞)移植后常規(guī)黃體支持，2周后檢測(cè)血HCG 當(dāng)血HCG>5 U/L，4～6周B超檢查見孕囊及胎心為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果

一、根據(jù)移植胚胎發(fā)育速度分組的患者一般臨床資料與結(jié)局

8～9細(xì)胞組、10～11細(xì)胞組和12～16細(xì)胞組3組患者的年齡、體重指數(shù)(BMI)、獲卵數(shù)、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、內(nèi)膜厚度等均無顯著差異(P>0.05)；3組間種植率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率亦無顯著差異(P>0.05)(表1)。

二、根據(jù)移植胚胎的卵裂球數(shù)目奇偶數(shù)分組的患者一般臨床資料與結(jié)局

奇數(shù)組和偶數(shù)組兩組患者的年齡、BMI、獲卵數(shù)、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、內(nèi)膜厚度等均無顯著差異(P>0.05)。兩組臨床結(jié)局比較，偶數(shù)組的種植率、活產(chǎn)率均顯著高于奇數(shù)組 (P<0.05)。偶數(shù)組的流產(chǎn)率低于奇數(shù)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表1 不同胚胎發(fā)育速度患者基本信息與臨床結(jié)局[(-±s)，%]

表2 卵裂球奇偶數(shù)患者基本信息與臨床結(jié)局[(-±s)，%]

注：與偶數(shù)組比較，*P<0.05

三、根據(jù)偶數(shù)卵裂球胚胎發(fā)育速度分組的患者一般臨床資料與結(jié)局

將卵裂球數(shù)目為偶數(shù)的胚胎按照胚胎發(fā)育速度分為8細(xì)胞組、10細(xì)胞組和12～16細(xì)胞組進(jìn)行分析，3組患者的年齡、BMI、獲卵數(shù)、FSH、LH、內(nèi)膜厚度等均無顯著差異(P>0.05)，3組間種植率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率亦無顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 不同發(fā)育速度的偶數(shù)卵裂球胚胎患者基本信息與臨床結(jié)局[(-±s)，%]

討論

單胚胎移植技術(shù)中胚胎選擇是關(guān)鍵，靜態(tài)學(xué)評(píng)估是目前大多數(shù)生殖中心常用的評(píng)價(jià)胚胎移植前活力的方式[8]。根據(jù)ESHERE發(fā)布的2011版Istanbul共識(shí)，在受精后(68±1)h觀察胚胎，綜合比較其卵裂球大小、數(shù)目、胞質(zhì)碎片、空泡等靜態(tài)學(xué)參數(shù)，從而挑選出最優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植。但形態(tài)學(xué)指標(biāo)并不能準(zhǔn)確地反映出胚胎發(fā)育的實(shí)際情況，其卵裂方式是否異常，卵裂是否同步均無法體現(xiàn)。近年來興起的時(shí)差成像技術(shù)通過連續(xù)攝像能夠有效克服這些弊端，Pribenszky等[9]研究證明，與普通培養(yǎng)箱經(jīng)靜態(tài)形態(tài)學(xué)參數(shù)評(píng)估相比，通過Time-lapse培養(yǎng)，運(yùn)用形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)挑選胚胎可顯著提高妊娠率及活產(chǎn)率。本中心前期研究證明，相對(duì)于傳統(tǒng)的靜態(tài)形態(tài)學(xué)評(píng)估，TLI挑選優(yōu)質(zhì)胚胎行Day 3單胚胎移植的臨床妊娠率可提高27%[10]。本研究所基于的時(shí)間參數(shù)是s2<0.5 h和發(fā)育至5細(xì)胞時(shí)間(t5)<48.93 h，有相關(guān)研究報(bào)道，在此時(shí)間參數(shù)范圍內(nèi)挑選的胚胎能夠有效提高患者的懷孕幾率，并減少多胎妊娠的發(fā)生[7]。

由于患者卵子與精子自身的原因，以及培養(yǎng)環(huán)境和操作損傷等影響，絕大部分受精卵并不能發(fā)育成優(yōu)質(zhì)的8細(xì)胞胚胎。較多胚胎發(fā)育速度較快，移植當(dāng)日已經(jīng)達(dá)到10細(xì)胞，有些甚至達(dá)到14細(xì)胞。在傳統(tǒng)的靜態(tài)形態(tài)學(xué)觀察下，在有形態(tài)較好的8細(xì)胞胚胎的情況下，10細(xì)胞及以上的胚胎一般不用于移植，將會(huì)繼續(xù)培養(yǎng)觀察。通過TLI，我們發(fā)現(xiàn)有許多胚胎于Day 3發(fā)育成8細(xì)胞，并且形態(tài)比較完美，但是卵裂過程可能存在許多異常事件,例如異常卵裂、卵裂球多核等[11]。Wong等[12]研究表明，兩個(gè)形態(tài)相同的胚胎可能會(huì)經(jīng)歷完全不同的發(fā)育過程。本研究通過TLI系統(tǒng)對(duì)胚胎發(fā)育進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，探究患者在無符合時(shí)間參數(shù)且卵裂球數(shù)目為8的優(yōu)質(zhì)可移植胚胎的情況下，挑選滿足時(shí)間參數(shù)且卵裂球數(shù)目大于8的胚胎移植，其臨床結(jié)果是否存在差異。結(jié)果顯示，在種植率方面，8～9細(xì)胞為61.90%，10～11細(xì)胞為53.80%，12～16細(xì)胞為53.33%，并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。而洪焱等[13]研究發(fā)現(xiàn)，大于8細(xì)胞的單胚胎著床率要低于8細(xì)胞胚胎，但其樣本量較少，可能是導(dǎo)致本研究結(jié)果與其不一致的原因。Chimote等[14]研究認(rèn)為，在發(fā)育速度較快的胚胎中約有70%左右的染色體異常者在囊胚形成過程中被淘汰，從而導(dǎo)致了囊胚的質(zhì)量相對(duì)提高，有著更好的發(fā)育潛能，這一現(xiàn)象在一定程度上解釋了本研究中移植卵裂球數(shù)目較多的胚胎，患者的流產(chǎn)率并沒有明顯提高，而Alikani等[15]通過對(duì)受精后第3天不同發(fā)育速度胚胎的囊胚形成比較發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞數(shù)為7～9的胚胎其囊胚形成率明顯高于細(xì)胞數(shù)>10的胚胎。

以往的研究早已證實(shí)，胚胎的卵裂球發(fā)育速度與染色體狀況有關(guān)[16]。在靜態(tài)學(xué)評(píng)分系統(tǒng)下，受精后Day 3，卵裂球數(shù)目大于10的胚胎經(jīng)常存在由于卵裂球排列緊密導(dǎo)致將碎片等胞質(zhì)結(jié)構(gòu)誤認(rèn)為卵裂球的現(xiàn)象。在細(xì)胞數(shù)較多的情況下，卵裂球和碎片的區(qū)別很難用肉眼去區(qū)分，尤其是在含有大碎片以及一些卵裂球嚴(yán)重不均的胚胎中更是如此[17]。靜態(tài)評(píng)分為10細(xì)胞乃至12細(xì)胞，很可能包含了 1至2個(gè)大碎片，這些細(xì)胞質(zhì)碎片是從受精胚胎或早期胚胎排出的膜包裹的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)，含DNA的可能性非常低。同時(shí)Alikani等[15]發(fā)現(xiàn)含有大碎片的胚胎與含有較小、分散碎片的胚胎相比，其種植率明顯降低。胚胎的發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，人為選擇胚胎觀察的特定時(shí)間點(diǎn)，根據(jù)形態(tài)參數(shù)和當(dāng)前的發(fā)育狀況選擇胚胎，本身就存在一定的局限性，在發(fā)育過程常發(fā)生的非二倍性卵裂方式，會(huì)導(dǎo)致在靜態(tài)學(xué)觀察下細(xì)胞發(fā)育過快。這都有可能是部分研究顯示大于10細(xì)胞的胚胎發(fā)育潛能低于7～9細(xì)胞的原因，而TLI技術(shù)通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可以有效避免這一問題。

本研究結(jié)果顯示，卵裂球數(shù)目為奇數(shù)的胚胎其種植率與活產(chǎn)率要顯著低于卵裂球數(shù)目為偶數(shù)的胚胎。這可能是由于卵裂球數(shù)目為偶數(shù)的胚胎染色體正常比例要高于奇數(shù)胚胎，與劉見橋等[18]研究結(jié)果相符。為避免卵裂球奇偶數(shù)對(duì)卵裂速度分組的影響，本研究將三組中卵裂球?yàn)槠鏀?shù)的胚胎去除后，分別對(duì)8細(xì)胞組，10細(xì)胞組，12～16細(xì)胞組進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，三組種植率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率均無顯著差異(P>0.05)，與不分卵裂球奇偶數(shù)的結(jié)果一致，表明本研究分組的結(jié)果不受卵裂球奇偶數(shù)的影響。

綜上所述，TLI技術(shù)是一種新興的胚胎監(jiān)測(cè)手段，能夠更加有效的幫助胚胎學(xué)家選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植。在本項(xiàng)研究中我們發(fā)現(xiàn)在同樣符合時(shí)間參數(shù)與卵裂模式的條件下，相對(duì)于8細(xì)胞而言，移植10細(xì)胞及以上的胚胎其種植率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率等方面并沒有顯著差異。在臨床助孕治療過程中，對(duì)于未獲得發(fā)育速度正常且符合時(shí)間參數(shù)的胚胎的患者而言，移植符合時(shí)間參數(shù)但是發(fā)育相對(duì)較快的胚胎仍然可以獲得較好的臨床結(jié)局。此研究不足之處在于移植10細(xì)胞以上和卵裂球數(shù)為奇數(shù)的胚胎樣本量相對(duì)較少，在今后的研究中，我們將不斷擴(kuò)大樣本量予以考證。