付殷 孫貴才 歐陽玉龍 溫浙旭

1.黑龍江中醫(yī)藥大學中藥學博士后流動工作站，黑龍江 哈爾濱 150000 2.南昌大學第四附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌 330003

淫羊藿苷(ICA)是中藥淫羊藿的有效成分。淫羊藿為小檗科多年生草本植物，歸肝、腎經(jīng)，性溫，味辛、甘?！侗静菥V目》記錄了淫羊藿其有“益精氣、堅筋骨、實腰膝心力”的效果。淫羊藿苷是從淫羊藿屬植物中分離得到的黃酮醇苷類化合物[1]。對治療骨質疏松癥類疾病效果顯著且不良反應小。淫羊藿及淫羊藿提取物通過對骨髓間充質干細胞誘導作用來激活成骨細胞的增殖分化及抑制破骨細胞的作用來促進骨的形成、抑制骨吸收，構建骨的平衡，進而有效地防治骨質疏松的發(fā)生發(fā)展[2]。淫羊藿苷的分子機制已經(jīng)證明其抗骨質疏松和成骨分化作用[3-4]以及其參與雌激素生物合成。

臨床應用鋰于治療造血系統(tǒng)疾病和雙極性疾病已經(jīng)有數(shù)十年[5]。越來越多的證據(jù)表明，鋰能夠刺激干細胞增殖，認為其是細胞治療機制之一[6]。研究人員已經(jīng)提出，鋰可以直接刺激骨髓間充質干細胞的增殖[7]。本研究意義在于嘗試聯(lián)合應用氯化鋰與淫羊藿苷能否提高成骨細胞增殖及分化作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

出生72 h的SD乳鼠，由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。動物合格證編號為SCXK黑2015004。

1.2 材料

淫羊藿苷(meilunbio，中國)，LiCl(Sigma, 美國)，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合液和胰酶(Hyclone, 美國)，CCK8(同仁，日本)，GSK3β、p-GSK3β、β- catenin、GAPDH抗體購于Abcam公司，維生素C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松(Sigma，美國)。茜素紅染液(索萊寶，中國)，PNPP(大連美倫，中國)。

1.3 成骨細胞分離與培養(yǎng)

無菌條件下取出出生72 h的SD乳鼠頭骨，置入4°C的PBS溶液中，然后應用眼科鑷與手術刀剔除表面的結締組織，用4°C的PBS溶液反復吹打清洗組織并將其剪成小于1 mm3的組織塊，將剪好的組織塊轉移到1.5 mL離心管中，加3倍體積的胰酶，將離心管置入37 ℃的恒溫搖床中進行消化，振蕩消化20 min后加入胎牛血清終止消化，放置于4 ℃冰箱中靜置5 min，舍棄上清液，加入0.2% Collagenase I，置于37 ℃的恒溫搖床中，消化并振蕩60 min后用胎牛血清終止消化，多次吹打后通過200目濾網(wǎng)過濾去除碎片[3]，收集濾液，1 200 r/min 離心8 min，棄上清液，用DMEM完全培養(yǎng)基進行重新懸浮細胞，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；2 d 后換液，之后間隔2～3 d 換1次培養(yǎng)液。并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況，取培養(yǎng)的第三代成骨細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 ICA對成骨細胞增殖能力影響

稱取一定量的ICA，用DMSO溶解，配制成為200 μmol/L的ICA貯備液，使用前用DMEM基礎培養(yǎng)液稀釋所需濃度，使DMSO的終濃度<0.1%。將成骨細密度調整為104/mL接種于96孔培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)，每孔加入200 μL置于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞長滿瓶底80%以上每孔中加入ICA終濃度為0、10、20、40、80 nmol/L 進行繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔中加入10 μL的CCK-8進行繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用酶標儀讀取波長為490 nm處的吸光度值。

1.5 LiCl對成骨細胞增殖影響

將成骨細胞密度調整為104/mL接種于96孔培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)，每孔加入200 μL置于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞長滿瓶底80%以上每孔中加入LiCl終濃度為0、2、5 nmol/L進行繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔中加入10 μL的CCK-8進行繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用酶標儀讀取波長為490 nm處的吸光度值。

1.6 LiCl與ICA聯(lián)合應用對成骨細胞增殖能力影響

將成骨細胞細密度調整為104/mL接種于96孔培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)，每孔加入200 μL置于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞長滿瓶底80%以上時將相應的孔板分為4組即空白組、ICA組(80 nmol/L)， LiCl(5 nmol/L)，ICA(80 nmol/L)+LiCl(5 nmol /L)組，加入相應的藥物，繼續(xù)進行培養(yǎng)24 h，每孔中加入10 μL的CCK-8進行繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用酶標儀讀取波長為490 nm處的吸光度。

1.7 鈣化結節(jié)染色與堿性磷酸酶活性測定

用第三代成骨細胞進行成骨性誘導，在礦化誘導培養(yǎng)基(100 nmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸、7 mol/L地塞米松)下培養(yǎng)。各組分別加入相應濃度藥物。接種于培養(yǎng)板中，分為空白組(礦化誘導培養(yǎng)基)、ICA組(80 nmol/L)， LiCl組(5 nmol /L)，ICA(80 nmol/L)+LiCl(5 nmol/L)組，空白組給予空白誘導培養(yǎng)液，進行誘導21 d后棄掉培養(yǎng)液，培養(yǎng)板用PBS溶液沖洗3次，室溫下使用95%乙醇固定15 min，雙蒸水沖洗3次，0.1%茜素紅[茜素紅-Tris-Hcl(pH 8.3)]染色，放置培養(yǎng)箱中1 h，使用雙蒸水沖洗3次。PNPP 法測定成骨細胞ALP 活性，成骨細胞培養(yǎng)21 d后棄培養(yǎng)液，應用PBS溶液沖洗2 遍，使用1% Triton X-100 反復凍融3 次，成骨細胞裂解物孵育在磷酸鹽底物中30 min，溫度為37 ℃，進而加入1 mol/L 的NaOH 終止反應，酶標儀在405 nm 下測定其吸光度值。根據(jù)蛋白質標準化的Sigma 校正曲線，計算各組成骨細胞酶活性[8]。

1.8 WB檢測成骨細胞中GSK3β、p-GSK3β、β- catenin蛋白含量

使用對數(shù)期的成骨細胞，并以2×104個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，每孔均勻2 000 μL，待細胞貼壁后換液，按照實驗分組給予相應的干預， 每孔2 000 μL。藥物干預2 d 后，提取各組成骨細胞總蛋白，并進行蛋白定量，經(jīng)12.5% SDS-PAGE電泳分離，轉移至PVDF膜上，將含有5%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖液室溫孵育1 h后，加入一抗稀釋液((1∶100稀釋)，于4 ℃過夜，應用含Tween-20的TBS緩沖液洗膜3次，間隔10 min/次，加入二抗工作液(1∶200稀釋)，在室溫下孵育1 h, TBST洗膜3次，間隔10 min/次，加入HRP標記的二抗工作液，室溫孵育1 h, TBST洗膜3次，間隔10 min/次，最后采用ECL法顯色。采用凝膠成像系統(tǒng)攝片并分析，結果以目的條帶與內參條帶(GAPDH)光密度的比值表示[9]。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 細胞形態(tài)

將成骨細胞在倒置顯微鏡下觀察，接種24 h左右細胞貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)72 h延伸出較多的突起，在培養(yǎng)到7～10 d后細胞融合為單層細胞，細胞多為單核、多邊形及梭形等，如圖1所示。

圖1 成骨細胞Fig.1 Osteoblasts (×100)

2.1 ICA對成骨細胞的增殖作用

如表1所示，CCK-8法檢測結果顯示不同濃度的ICA都能對成骨細胞增殖產(chǎn)生不同程度作用，但是低濃度差異不顯著。成骨細胞生長率隨著淫羊藿的濃度升高而增加。

表1不同濃度淫羊藿對成骨細胞增殖作用影響

Table1Effects of different concentrations of epimedium on the proliferation of osteoblasts

濃度/ (nmol/L)OD值0 0.7493±0.042650.8188±0.014?100.8843±0.0327?200.8921±0.0456?800.9173±0.0376?

注：與0 nmol/L比較，*P<0.05。

2.2 LiCl對成骨細胞的增殖作用

如表2所示，CCK-8法檢測結果顯示一定濃度下氯化鋰都能對成骨細胞增殖產(chǎn)生不同程度的促進作用，并且各不同濃度組的OD值比較，差異具有統(tǒng)計學意義。

表2LiCl對成骨細胞增殖作用影響

Table2Effect of lithium chloride on the proliferation of osteoblasts

濃度/ (nmol/L)OD值00.6906±0.020820.7571±0.0123?50.8837±0.0764?

注：與0 nmol/L比較，*P<0.05。

2.3 LiCl與ICA聯(lián)合應用對成骨細胞增殖的影響

如表3所示，CCK-8法檢測結果顯示與空白組比較， ICA組、LiCl組和LiCl與ICA聯(lián)合組對成骨細胞的增殖具均有促進作用，與淫羊藿苷組和氯化鋰組比較，淫羊藿苷聯(lián)合氯化鋰組對成骨細胞的增殖更具有明顯促進作用。

表3淫羊藿苷聯(lián)合氯化鋰對成骨細胞增殖影響

Table3Effect of icariin combined with lithium chloride on the proliferation of osteoblasts

組別OD值空白組0.7126±0.0344淫羊藿苷組0.8583±0.0342#?氯化鋰組0.9277±0.0231#?淫羊藿苷+氯化鋰組0.9519±0.0342#

注：與空白組比較，#P<0.05；與淫羊藿苷+氯化鋰組比較，*P<0.05。

2.4 茜素紅染色與ALP 活性

茜素紅染色結果如圖2所示，結果表明淫羊藿苷、氯化鋰、淫羊藿苷聯(lián)合氯化鋰處理的成骨細胞的礦化能力明顯增加，相對于空白組，ICA組、LiCl組和LiCl與ICA聯(lián)合組的成骨細胞礦化能力明顯增加，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且以LiCl與ICA聯(lián)合組處理細胞鈣化能力最強。圖3所示ALP 活性定量結果表明LiCl組、ICA組以及LiCl與ICA聯(lián)合組處理的成骨細胞的活性明顯增加，相對于空白組，且以LiCl與ICA聯(lián)合組成骨細胞ALP 活性最高，結果表明LiCl與ICA聯(lián)合組對成骨細胞的礦化能力和活性影響明顯強于單獨使用的效果。

圖5 成骨細胞中p-GSK3β，β- catenin表達的定量結果Fig.5 Expression of p-GSK3β and β-catenin in osteoblasts

圖2 成骨細胞鈣化結節(jié)染色Fig.2 Staining of calcified nodules by osteoblasts

圖3 ALP成骨細胞活性Fig.3 ALP activity of osteoblasts

2.5 各組對成骨細胞中p-GSK3β、β- catenin表達影響

經(jīng)過ICA組、LiCl組以及LiCl與ICA聯(lián)合組的處理，各組成骨細胞 p-GSK3β及 β- catenin蛋白表達的結果見圖4～5所示，定量結果如圖5所示，結果表明ICA組、LiCl組以及LiCl與ICA聯(lián)合組處理的各組成骨細胞的p-GSK3β及 β- catenin蛋白表達明顯增加，相對于對照組，且以LiCl與ICA聯(lián)合組細胞 p-GSK3β及 β- catenin蛋白表達量最多，明顯優(yōu)于單獨使用的效果。

圖4 各組中p-GSK3β、β- catenin及GAPDH表達注：1 對照組；2 ICA組；3 LiCl組；4 LiCl與ICA聯(lián)合組Fig.4 Expression of p-GSK3β, β- catenin and GAPDH among groups

3 討論

骨質疏松癥是以骨的微觀結構減弱為主要表現(xiàn)特征，骨強度下降和骨脆性增加為主要臨床表現(xiàn)[10]，多發(fā)生于老年人群，嚴重危害著患者的生活質量。骨質疏松由于成骨細胞與破骨細胞生理狀態(tài)異常所致[11]。近年來的研究已經(jīng)證明，淫羊藿苷可通過上調成骨細胞核心結合因子 α1 (Cbfα1)、BMP-2、BMP-4 mRNA 和 Runx2 的表達而促進成骨細胞骨形成[12]。進而提高骨密度，促進成骨細胞增殖和分化、增加松質骨骨量及抑制骨吸收的作用[13-14]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)氯化鋰既能促進成骨細胞增殖又能抑制破骨細胞吸收，在骨修復和骨重建中都能起到重要作用[15]，表明氯化鋰是可以用來治療絕經(jīng)后骨質疏松癥。最近研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷和氯化鋰均是通過促進成骨細胞增殖和抑制破骨的骨吸收來治療骨質疏松癥，嘗試研究淫羊藿苷與氯化鋰聯(lián)合應用是否具有有疊加促進骨質疏松癥的潛力。鑒于此，本實驗研究淫羊藿苷與氯化鋰聯(lián)合治療骨質疏松癥是否有優(yōu)于單獨治療骨質疏松癥的潛力，為此本研究分析淫羊藿苷與氯化鋰聯(lián)合作用成骨細胞，觀察其對成骨細胞增殖和礦化能力的影響，并且探討其對骨質疏松癥治療的可行性。

通過LiCl與ICA聯(lián)合應用發(fā)現(xiàn)其可增強成骨細胞的礦化能力，實驗同時檢測ICA組、LiCl組及LiCl與ICA聯(lián)合應用組間的茜素紅染色，作為成骨細胞分化特異性檢測標準。與單獨用藥組比較，LiCl與ICA聯(lián)合應用組更能提高促進礦化結節(jié)能力，說明LiCl與ICA聯(lián)合應用更能促進成骨分化。

經(jīng)典Wnt /β-catenin 信號通路在成骨細胞的生成及骨形成過程中起到重要的作用，而淫羊藿苷+氯化鋰組通過調節(jié)Wnt 信號通路GSK-3β的磷酸化從而抑制胞質內β-catenin的磷酸化和降解，進而增加胞質內β-catenin 聚集并轉入細胞胞核。從而激活下游靶基因促進成骨細胞分化。

本研究從細胞水平與分子水平闡述了LiCl與ICA聯(lián)合應用能更好地提高成骨細胞礦化能力，抑制GSK-3β的磷酸化及提高β-catenin 總蛋白的表達，進而促進成骨細胞的增殖和分化。