付殷 孫貴才 歐陽玉龍 溫浙旭

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)博士后流動(dòng)工作站，黑龍江 哈爾濱 150000 2.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌 330003

淫羊藿苷(ICA)是中藥淫羊藿的有效成分。淫羊藿為小檗科多年生草本植物，歸肝、腎經(jīng)，性溫，味辛、甘?！侗静菥V目》記錄了淫羊藿其有“益精氣、堅(jiān)筋骨、實(shí)腰膝心力”的效果。淫羊藿苷是從淫羊藿屬植物中分離得到的黃酮醇苷類化合物[1]。對(duì)治療骨質(zhì)疏松癥類疾病效果顯著且不良反應(yīng)小。淫羊藿及淫羊藿提取物通過對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)作用來激活成骨細(xì)胞的增殖分化及抑制破骨細(xì)胞的作用來促進(jìn)骨的形成、抑制骨吸收，構(gòu)建骨的平衡，進(jìn)而有效地防治骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展[2]。淫羊藿苷的分子機(jī)制已經(jīng)證明其抗骨質(zhì)疏松和成骨分化作用[3-4]以及其參與雌激素生物合成。

臨床應(yīng)用鋰于治療造血系統(tǒng)疾病和雙極性疾病已經(jīng)有數(shù)十年[5]。越來越多的證據(jù)表明，鋰能夠刺激干細(xì)胞增殖，認(rèn)為其是細(xì)胞治療機(jī)制之一[6]。研究人員已經(jīng)提出，鋰可以直接刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖[7]。本研究意義在于嘗試聯(lián)合應(yīng)用氯化鋰與淫羊藿苷能否提高成骨細(xì)胞增殖及分化作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生72 h的SD乳鼠，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證編號(hào)為SCXK黑2015004。

1.2 材料

淫羊藿苷(meilunbio，中國(guó))，LiCl(Sigma, 美國(guó))，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合液和胰酶(Hyclone, 美國(guó))，CCK8(同仁，日本)，GSK3β、p-GSK3β、β- catenin、GAPDH抗體購于Abcam公司，維生素C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松(Sigma，美國(guó))。茜素紅染液(索萊寶，中國(guó))，PNPP(大連美倫，中國(guó))。

1.3 成骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)

無菌條件下取出出生72 h的SD乳鼠頭骨，置入4°C的PBS溶液中，然后應(yīng)用眼科鑷與手術(shù)刀剔除表面的結(jié)締組織，用4°C的PBS溶液反復(fù)吹打清洗組織并將其剪成小于1 mm3的組織塊，將剪好的組織塊轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，加3倍體積的胰酶，將離心管置入37 ℃的恒溫?fù)u床中進(jìn)行消化，振蕩消化20 min后加入胎牛血清終止消化，放置于4 ℃冰箱中靜置5 min，舍棄上清液，加入0.2% Collagenase I，置于37 ℃的恒溫?fù)u床中，消化并振蕩60 min后用胎牛血清終止消化，多次吹打后通過200目濾網(wǎng)過濾去除碎片[3]，收集濾液，1 200 r/min 離心8 min，棄上清液，用DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行重新懸浮細(xì)胞，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；2 d 后換液，之后間隔2～3 d 換1次培養(yǎng)液。并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況，取培養(yǎng)的第三代成骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 ICA對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力影響

稱取一定量的ICA，用DMSO溶解，配制成為200 μmol/L的ICA貯備液，使用前用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋所需濃度，使DMSO的終濃度<0.1%。將成骨細(xì)密度調(diào)整為104/mL接種于96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔加入200 μL置于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%以上每孔中加入ICA終濃度為0、10、20、40、80 nmol/L 進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔中加入10 μL的CCK-8進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)為490 nm處的吸光度值。

1.5 LiCl對(duì)成骨細(xì)胞增殖影響

將成骨細(xì)胞密度調(diào)整為104/mL接種于96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔加入200 μL置于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%以上每孔中加入LiCl終濃度為0、2、5 nmol/L進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔中加入10 μL的CCK-8進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)為490 nm處的吸光度值。

1.6 LiCl與ICA聯(lián)合應(yīng)用對(duì)成骨細(xì)胞增殖能力影響

將成骨細(xì)胞細(xì)密度調(diào)整為104/mL接種于96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)，每孔加入200 μL置于5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%以上時(shí)將相應(yīng)的孔板分為4組即空白組、ICA組(80 nmol/L)， LiCl(5 nmol/L)，ICA(80 nmol/L)+LiCl(5 nmol /L)組，加入相應(yīng)的藥物，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)24 h，每孔中加入10 μL的CCK-8進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，用酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)為490 nm處的吸光度。

1.7 鈣化結(jié)節(jié)染色與堿性磷酸酶活性測(cè)定

用第三代成骨細(xì)胞進(jìn)行成骨性誘導(dǎo)，在礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(100 nmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸、7 mol/L地塞米松)下培養(yǎng)。各組分別加入相應(yīng)濃度藥物。接種于培養(yǎng)板中，分為空白組(礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基)、ICA組(80 nmol/L)， LiCl組(5 nmol /L)，ICA(80 nmol/L)+LiCl(5 nmol/L)組，空白組給予空白誘導(dǎo)培養(yǎng)液，進(jìn)行誘導(dǎo)21 d后棄掉培養(yǎng)液，培養(yǎng)板用PBS溶液沖洗3次，室溫下使用95%乙醇固定15 min，雙蒸水沖洗3次，0.1%茜素紅[茜素紅-Tris-Hcl(pH 8.3)]染色，放置培養(yǎng)箱中1 h，使用雙蒸水沖洗3次。PNPP 法測(cè)定成骨細(xì)胞ALP 活性，成骨細(xì)胞培養(yǎng)21 d后棄培養(yǎng)液，應(yīng)用PBS溶液沖洗2 遍，使用1% Triton X-100 反復(fù)凍融3 次，成骨細(xì)胞裂解物孵育在磷酸鹽底物中30 min，溫度為37 ℃，進(jìn)而加入1 mol/L 的NaOH 終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀在405 nm 下測(cè)定其吸光度值。根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化的Sigma 校正曲線，計(jì)算各組成骨細(xì)胞酶活性[8]。

1.8 WB檢測(cè)成骨細(xì)胞中GSK3β、p-GSK3β、β- catenin蛋白含量

使用對(duì)數(shù)期的成骨細(xì)胞，并以2×104個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，每孔均勻2 000 μL，待細(xì)胞貼壁后換液，按照實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)的干預(yù)， 每孔2 000 μL。藥物干預(yù)2 d 后，提取各組成骨細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)12.5% SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將含有5%脫脂奶粉的Tris-HCl緩沖液室溫孵育1 h后，加入一抗稀釋液((1∶100稀釋)，于4 ℃過夜，應(yīng)用含Tween-20的TBS緩沖液洗膜3次，間隔10 min/次，加入二抗工作液(1∶200稀釋)，在室溫下孵育1 h, TBST洗膜3次，間隔10 min/次，加入HRP標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育1 h, TBST洗膜3次，間隔10 min/次，最后采用ECL法顯色。采用凝膠成像系統(tǒng)攝片并分析，結(jié)果以目的條帶與內(nèi)參條帶(GAPDH)光密度的比值表示[9]。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

將成骨細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，接種24 h左右細(xì)胞貼壁，繼續(xù)培養(yǎng)72 h延伸出較多的突起，在培養(yǎng)到7～10 d后細(xì)胞融合為單層細(xì)胞，細(xì)胞多為單核、多邊形及梭形等，如圖1所示。

圖1 成骨細(xì)胞Fig.1 Osteoblasts (×100)

2.1 ICA對(duì)成骨細(xì)胞的增殖作用

如表1所示，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示不同濃度的ICA都能對(duì)成骨細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同程度作用，但是低濃度差異不顯著。成骨細(xì)胞生長(zhǎng)率隨著淫羊藿的濃度升高而增加。

表1不同濃度淫羊藿對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用影響

Table1Effects of different concentrations of epimedium on the proliferation of osteoblasts

濃度/ (nmol/L)OD值0 0.7493±0.042650.8188±0.014?100.8843±0.0327?200.8921±0.0456?800.9173±0.0376?

注：與0 nmol/L比較，*P<0.05。

2.2 LiCl對(duì)成骨細(xì)胞的增殖作用

如表2所示，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示一定濃度下氯化鋰都能對(duì)成骨細(xì)胞增殖產(chǎn)生不同程度的促進(jìn)作用，并且各不同濃度組的OD值比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2LiCl對(duì)成骨細(xì)胞增殖作用影響

Table2Effect of lithium chloride on the proliferation of osteoblasts

濃度/ (nmol/L)OD值00.6906±0.020820.7571±0.0123?50.8837±0.0764?

注：與0 nmol/L比較，*P<0.05。

2.3 LiCl與ICA聯(lián)合應(yīng)用對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

如表3所示，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示與空白組比較， ICA組、LiCl組和LiCl與ICA聯(lián)合組對(duì)成骨細(xì)胞的增殖具均有促進(jìn)作用，與淫羊藿苷組和氯化鋰組比較，淫羊藿苷聯(lián)合氯化鋰組對(duì)成骨細(xì)胞的增殖更具有明顯促進(jìn)作用。

表3淫羊藿苷聯(lián)合氯化鋰對(duì)成骨細(xì)胞增殖影響

Table3Effect of icariin combined with lithium chloride on the proliferation of osteoblasts

組別OD值空白組0.7126±0.0344淫羊藿苷組0.8583±0.0342#?氯化鋰組0.9277±0.0231#?淫羊藿苷+氯化鋰組0.9519±0.0342#

注：與空白組比較，#P<0.05；與淫羊藿苷+氯化鋰組比較，*P<0.05。

2.4 茜素紅染色與ALP 活性

茜素紅染色結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明淫羊藿苷、氯化鋰、淫羊藿苷聯(lián)合氯化鋰處理的成骨細(xì)胞的礦化能力明顯增加，相對(duì)于空白組，ICA組、LiCl組和LiCl與ICA聯(lián)合組的成骨細(xì)胞礦化能力明顯增加，與空白組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且以LiCl與ICA聯(lián)合組處理細(xì)胞鈣化能力最強(qiáng)。圖3所示ALP 活性定量結(jié)果表明LiCl組、ICA組以及LiCl與ICA聯(lián)合組處理的成骨細(xì)胞的活性明顯增加，相對(duì)于空白組，且以LiCl與ICA聯(lián)合組成骨細(xì)胞ALP 活性最高，結(jié)果表明LiCl與ICA聯(lián)合組對(duì)成骨細(xì)胞的礦化能力和活性影響明顯強(qiáng)于單獨(dú)使用的效果。

圖5 成骨細(xì)胞中p-GSK3β，β- catenin表達(dá)的定量結(jié)果Fig.5 Expression of p-GSK3β and β-catenin in osteoblasts

圖2 成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)染色Fig.2 Staining of calcified nodules by osteoblasts

圖3 ALP成骨細(xì)胞活性Fig.3 ALP activity of osteoblasts

2.5 各組對(duì)成骨細(xì)胞中p-GSK3β、β- catenin表達(dá)影響

經(jīng)過ICA組、LiCl組以及LiCl與ICA聯(lián)合組的處理，各組成骨細(xì)胞 p-GSK3β及 β- catenin蛋白表達(dá)的結(jié)果見圖4～5所示，定量結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明ICA組、LiCl組以及LiCl與ICA聯(lián)合組處理的各組成骨細(xì)胞的p-GSK3β及 β- catenin蛋白表達(dá)明顯增加，相對(duì)于對(duì)照組，且以LiCl與ICA聯(lián)合組細(xì)胞 p-GSK3β及 β- catenin蛋白表達(dá)量最多，明顯優(yōu)于單獨(dú)使用的效果。

圖4 各組中p-GSK3β、β- catenin及GAPDH表達(dá)注：1 對(duì)照組；2 ICA組；3 LiCl組；4 LiCl與ICA聯(lián)合組Fig.4 Expression of p-GSK3β, β- catenin and GAPDH among groups

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是以骨的微觀結(jié)構(gòu)減弱為主要表現(xiàn)特征，骨強(qiáng)度下降和骨脆性增加為主要臨床表現(xiàn)[10]，多發(fā)生于老年人群，嚴(yán)重危害著患者的生活質(zhì)量。骨質(zhì)疏松由于成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞生理狀態(tài)異常所致[11]。近年來的研究已經(jīng)證明，淫羊藿苷可通過上調(diào)成骨細(xì)胞核心結(jié)合因子 α1 (Cbfα1)、BMP-2、BMP-4 mRNA 和 Runx2 的表達(dá)而促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成[12]。進(jìn)而提高骨密度，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化、增加松質(zhì)骨骨量及抑制骨吸收的作用[13-14]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)氯化鋰既能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖又能抑制破骨細(xì)胞吸收，在骨修復(fù)和骨重建中都能起到重要作用[15]，表明氯化鋰是可以用來治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。最近研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷和氯化鋰均是通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和抑制破骨的骨吸收來治療骨質(zhì)疏松癥，嘗試研究淫羊藿苷與氯化鋰聯(lián)合應(yīng)用是否具有有疊加促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的潛力。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)研究淫羊藿苷與氯化鋰聯(lián)合治療骨質(zhì)疏松癥是否有優(yōu)于單獨(dú)治療骨質(zhì)疏松癥的潛力，為此本研究分析淫羊藿苷與氯化鋰聯(lián)合作用成骨細(xì)胞，觀察其對(duì)成骨細(xì)胞增殖和礦化能力的影響，并且探討其對(duì)骨質(zhì)疏松癥治療的可行性。

通過LiCl與ICA聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其可增強(qiáng)成骨細(xì)胞的礦化能力，實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)ICA組、LiCl組及LiCl與ICA聯(lián)合應(yīng)用組間的茜素紅染色，作為成骨細(xì)胞分化特異性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。與單獨(dú)用藥組比較，LiCl與ICA聯(lián)合應(yīng)用組更能提高促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)能力，說明LiCl與ICA聯(lián)合應(yīng)用更能促進(jìn)成骨分化。

經(jīng)典Wnt /β-catenin 信號(hào)通路在成骨細(xì)胞的生成及骨形成過程中起到重要的作用，而淫羊藿苷+氯化鋰組通過調(diào)節(jié)Wnt 信號(hào)通路GSK-3β的磷酸化從而抑制胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的磷酸化和降解，進(jìn)而增加胞質(zhì)內(nèi)β-catenin 聚集并轉(zhuǎn)入細(xì)胞胞核。從而激活下游靶基因促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。

本研究從細(xì)胞水平與分子水平闡述了LiCl與ICA聯(lián)合應(yīng)用能更好地提高成骨細(xì)胞礦化能力，抑制GSK-3β的磷酸化及提高β-catenin 總蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。