杜秀藩 黃弘軒 熊小龍 曾維鵬 黃暉 王廣積 沈?qū)幗?林堅平

1.海南省人民醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，海南 ?？?570311 2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510230

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的慢性骨疾病，其特征在于骨微結(jié)構(gòu)的惡化和骨量的減少。它影響兩性，但是在女性中與男性相比更常見[1-3]。在絕經(jīng)后期骨質(zhì)流失更快。骨質(zhì)疏松癥最重要的后果是發(fā)生在椎體、髖部和前臂的骨折。特別是髖部骨折是死亡率和發(fā)病率的重要原因。隨著預(yù)期壽命的增加，這種并發(fā)癥的發(fā)生會更為頻繁[4]。骨質(zhì)疏松癥隱襲發(fā)展，其臨床癥狀可能不會出現(xiàn)，直到骨折發(fā)生。在后期，臨床上表現(xiàn)為突發(fā)性骨折。因此，通過早期診斷和正確治療可以預(yù)防骨質(zhì)疏松癥，這一點非常重要。目前常用于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物是雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素、雌激素、重組人甲狀旁腺激素片段等；較高的不良反應(yīng)如非典型股骨骨折、雙膦酸鹽相關(guān)的頜骨壞死、高鈣血癥、血栓栓塞、陰道出血甚至乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌嚴(yán)重限制這些藥物的廣泛使用，因此，療效滿意且不良反應(yīng)小的藥物值得深入研究。大多數(shù)植物來源的中藥可能是一種具有廣闊應(yīng)用前景的藥物。肉桂醛是一種從肉桂皮中提取的醛類成分，已知可用于抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而提供抗菌活性。最近，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)用肉桂可抑制核因子-κB配體誘導(dǎo)活化T細(xì)胞核因子和激活c-fos表達(dá)，并且肉桂醛可以有效抑制破骨細(xì)胞樣細(xì)胞形成[5]，這些結(jié)果可以得到一個假設(shè)，肉桂醛(RGQ)具有治療骨質(zhì)疏松的潛力。本研究的目的是研究肉桂醛對大鼠去卵巢手術(shù)誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型中BMD和微結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

在該研究中，使用24只健康的成熟雌性Sprague-Dawley大鼠，每只體重220～250 g。動物隨意喂養(yǎng)，并與溫度控制環(huán)境22±2 ℃和12 h光照/黑暗周期成對飼養(yǎng)在鋼籠中。實驗程序由我院動物研究委員會批準(zhǔn)。所有的動物研究都嚴(yán)格按照人類關(guān)懷委員會的動物實驗指南進(jìn)行。

1.2 實驗設(shè)計

24只大鼠進(jìn)行雙側(cè)背側(cè)卵巢切除術(shù)(OVX)，8只大鼠未進(jìn)行卵巢切除術(shù)。對于外科手術(shù)，通過腹膜內(nèi)注射劑量為80和7 mg/kg甲苯噻嗪鹽酸鹽(Alfazyne; Alfasan International BV，Woerden，Holland)和鹽酸氯胺酮的組合麻醉大鼠。所有大鼠在去卵巢手術(shù)8周后。將他們分成3組。CON組(n=8)是對照組和未治療。OVX組(n=8)是OVX大鼠和未治療；RGQ組(n=8) OVX大鼠給予肉桂醛75 mg/(kg·d)治療，根據(jù)之前的實驗研究選擇肉桂醛的劑量[6]。治療12周后，通過Hologic QDR-4 500 A和“小動物”程序測量全身麻醉下左股骨近端和腰椎兩個區(qū)域的大鼠BMD。然后將動物安樂死，采集血樣、取出股骨進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.3 骨組織病理學(xué)檢查

對于組織學(xué)和免疫組織化學(xué)研究，所有動物通過腹膜內(nèi)麻醉。使用氯胺酮(80 mg/kg，Ege Vet，Alfasan International BV，Holland)/甲苯噻嗪(7 mg/kg，Ege Vet，Alfasan International BV，荷蘭)進(jìn)行過量麻醉處死大鼠。解剖動物的左股骨并在室溫10%甲醛固定劑中保存24 h用于組織形態(tài)計量學(xué)分析。將標(biāo)本放入10%甲酸中。脫鈣28 d，然后用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行常規(guī)檢查。用Leica MR 2145切片機將脫鈣固定的左股骨橫切成厚3 μm切片，用蘇木精-伊紅染色后進(jìn)行形態(tài)測定分析。

1.4 骨小梁形態(tài)測量分析

對于每只動物，從石蠟塊的左后肢股骨近端干骺端連續(xù)獲得5張橫切片，用于形態(tài)測定分析。切片用蘇木精-伊紅染色，并用奧林巴斯顯微鏡拍攝20倍變焦數(shù)碼照片。使用半自動數(shù)字系統(tǒng)UTHSCSA Image Tools for Windows Version 1.28測量了小梁計數(shù)、小梁厚度、小梁面積和小梁分離度。小梁測量在骺板附近0.46 mm處并且于股骨皮層兩側(cè)等距離處進(jìn)行。使用該程序?qū)㈤L度計算為像素(1像素=128×10-8mm)。所有測量均按照Parfit等[7]的文章進(jìn)行。

1.5 形態(tài)測量

對于小梁厚度(μm)和小梁分離度，需對每個小梁至少50個不同點處進(jìn)行測量，直到平均值變得恒定。通過計數(shù)所有骨小梁和每個小梁彼此平行，距離皮層兩側(cè)等距離的骨骺板0.46 mm處，獲得小梁計數(shù)。小梁面積(mm2)通過確定小梁的邊界在該區(qū)域測量小梁的數(shù)量來計算。

1.6 血清細(xì)胞因子水平的測量

將血液在室溫下以3 000 r/min離心10 min并儲存于-20 ℃?zhèn)錅y。使用針對IL-6和TNF-α的市售酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(eBiosciences，Inc，San Diego，CA)測量細(xì)胞因子水平。根據(jù)制造商提供的指南嚴(yán)格進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

使用非參數(shù)(Mann-WhitneyU)檢驗分析所有定量數(shù)據(jù)。Student的t檢驗被用來評估組間的差異。通過Kruskal-Wallis方差分析評估組間和組內(nèi)的血清TNF-α和IL-6水平。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05被認(rèn)為是差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨密度檢測

各組之間的平均BMD值和組織形態(tài)學(xué)結(jié)果如表1所示。OVX組與CON組比較，股骨和腰椎BMD值顯著降低(P<0.05)。在左側(cè)股骨近端和腰椎BMD值方面，RGQ組和OVX組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。

表1 各組平均BMD值 (g/cm2)Table 1 Mean BMD values among the groups (g/cm2)

注：和CON組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

2.2 組織形態(tài)測量結(jié)果

OVX組的小梁數(shù)量、小梁厚度和小梁面積均顯著低于對照組(P<0.05)。另外，OVX組小梁分離度顯著高于對照組(P<0.05) (表2)。與OVX組相比，RGQ治療顯著增加小梁數(shù)量，小梁厚度和小梁面積并減少小梁分離度；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。圖1顯示了各組大鼠股骨骨小梁的組織學(xué)切片。

表2 各組之間的組織形態(tài)測量結(jié)果Table 2 Histomorphometric results among the groups

注：和CON組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

圖1 大鼠股骨骨小梁H&E染色注：A CON組；B OVX組；C RGQ組 (×20)。Fig.1 HE staining of the trabecular of the rat femurs

2.3 血清細(xì)胞因子水平

各組的血清細(xì)胞因子水平示于表3中。OVX組中的TNF-α和IL-6水平顯著高于對照組(P<0.05)。與OVX組相比，RGQ治療顯著降低TNF-α和IL-6水平(P<0.05)。

表3 各組之間的平均血漿細(xì)胞因子水平Table 3 Mean plasma cytokine levels among the groups

注：和CON組比較，*P<0.05；和OVX組比較，#P<0.05。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后婦女中常見的代謝性骨病。由于隨著年齡的增長出現(xiàn)卵巢老化，雌激素合成的減少，表現(xiàn)為骨骼系統(tǒng)中的BMD減少和骨骼中的微結(jié)構(gòu)惡化。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是最常見的骨質(zhì)疏松癥類型。在我們的研究中，RGQ治療對大鼠手術(shù)誘導(dǎo)的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型中的小梁骨微構(gòu)造顯示出相當(dāng)大的保護(hù)作用。同時，股骨和腰椎骨密度均觀察到這種效應(yīng)。另外，RGQ的抗炎特性可以歸因于保護(hù)作用。Bagi等[8]通過骨密度和組織形態(tài)計量學(xué)分析研究了卵巢切除術(shù)對大鼠骨量和骨強度的影響。他們觀察到卵巢切除術(shù)可增加骨吸收，從而導(dǎo)致小梁數(shù)量、小梁厚度和骨強度的顯著下降。Siu等[9]還在哺乳動物卵巢切除術(shù)之前和之后6個月使用高分辨率計算機斷層掃描(CT)以及使用定量CT的BMD研究了骨微結(jié)構(gòu)。在那項研究中，他們確定卵巢切除導(dǎo)致BMD減少以及所有微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化。至于骨的脆性，研究骨微結(jié)構(gòu)與骨質(zhì)疏松性骨折之間關(guān)系的觀察性研究揭示了骨密度變化對骨結(jié)構(gòu)的決定性作用，獨立于BMD，同時研究指出，骨微結(jié)構(gòu)是骨質(zhì)量的重要組成部分，并為骨完整性提供重要貢獻(xiàn)[10]。在我們的研究中，與對照組相比，除了卵巢切除術(shù)組的骨小梁微結(jié)構(gòu)變化之外， BMD也有顯著減少。

肉桂醛，肉桂樹皮提取物，已知具有抗炎和抗癌的作用[11]。然而，肉桂醛的抗骨質(zhì)疏松作用尚未在體內(nèi)廣泛地研究。本研究觀察肉桂醛對去卵巢大鼠骨量和骨強度的影響。從結(jié)果來看，肉桂醛治療的效果明顯，肉桂醛能顯著促進(jìn)骨小梁的形成。此外，定量結(jié)果更好顯示骨小梁檢測的參數(shù)。隨著肉桂醛的使用，骨密度(BMD)顯著增高，骨強度明顯增加。在細(xì)胞水平上，有學(xué)者使用來自肉桂皮的乙醇提取物顯著誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的生長，這是一種ER陽性的人乳腺癌細(xì)胞系，驗證了肉桂乙醇提取物中植物雌激素的功能。并且他們還發(fā)現(xiàn)該提取物增加成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性，膠原合成和骨鈣素分泌[12]。此外，肉桂醛具有抑制破骨細(xì)胞功能的效果；有學(xué)者發(fā)現(xiàn)肉桂醛能抑制破骨細(xì)胞樣細(xì)胞形成和骨再吸收活性，主要目標(biāo)被認(rèn)為是c-fos / NFATc1途徑[5]。NF-κB是一種調(diào)節(jié)炎癥和免疫基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在骨質(zhì)疏松癥進(jìn)展中也起著至關(guān)重要的作用。抑制NF-κB是抑制破骨細(xì)胞形成和骨吸收活性的有效方法，有學(xué)者指出，肉桂醛對NF-κB轉(zhuǎn)錄活性具有抑制作用[13]。在本研究中，OVX后破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，并且隨著肉桂醛的處理，其數(shù)量逐漸減少，從而抑制骨吸收活性。隨著成骨細(xì)胞和骨形成的增加，骨代謝趨于平衡，然后骨質(zhì)疏松癥得到改善。

一些研究表明炎癥可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。有研究[14]表明在接受卵巢切除術(shù)的健康大鼠中IL-1和TNF-α增加，在卵巢切除術(shù)后8周達(dá)到最高水平，他們發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞因子水平的變化與骨吸收指數(shù)相關(guān)；此外在雌激素缺乏期間細(xì)胞因子如IL-6，IL-1，TNF-α和IL-8的產(chǎn)生增加誘導(dǎo)骨吸收；肝勻漿中測得的TNF-α，IL-1和IL-6顯著增加，在去大鼠卵巢后血清IL-6和TNF-α水平顯著升高。RGQ顯示有效的抗炎作用，在細(xì)胞和分子水平發(fā)揮快速抗炎作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與未治療組相比，RGQ治療的去卵巢大鼠血漿IL-6和TNF-α水平顯著降低。為了預(yù)防繼發(fā)于更年期的骨質(zhì)疏松癥，已經(jīng)將多種藥物用于治療，并且新藥的研究仍在進(jìn)行中。

研究結(jié)果顯示，我們不僅檢測到RGQ對BMD的積極的影響，同時也發(fā)現(xiàn)它對骨微結(jié)構(gòu)具有顯著的保護(hù)作用。另外，RGQ治療的血清IL-6和TNF-α水平顯著下降。總之，RGQ可能是用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的候選藥物。但是，需要進(jìn)行進(jìn)一步的臨床試驗。