郭文旭，尹昌浩，葛鵬飛，關(guān)亞新

缺血性腦卒中是導(dǎo)致成年人死亡和長期殘疾的主要原因之一[1，2]，約占所有卒中患者的87%[3]。目前，靜脈溶栓是改善急性缺血性卒中后果的最有效的藥物治療方法。然而，溶栓治療具有一定的時(shí)間窗限制并且可能誘發(fā)多種并發(fā)癥。因此，治療缺血性卒中需要更好的方法，減少缺血性損傷被認(rèn)為是治療它的有效措施。

自噬是生物體在進(jìn)化上相當(dāng)保守且對細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有高度調(diào)節(jié)作用的一種過程，通過該過程細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)及受損的細(xì)胞器被溶酶體系統(tǒng)進(jìn)行降解[4]。自噬在細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)節(jié)中可能起著雙重調(diào)節(jié)作用。一方面，在細(xì)胞內(nèi)部或外部的壓力下，自噬過程促使細(xì)胞存活下來，如自噬通過保護(hù)腦組織免受癲癇、神經(jīng)退行性疾病及阿爾茲海默病引起的損害[5～7]。另一方面，過度的細(xì)胞自噬通過細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白及重要細(xì)胞器的過度自我降解觸發(fā)了非凋亡的程序性死亡(即自噬性死亡)，如海藻糖通過抑制活性氧(ROS)依賴性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和AMPK的激活，阻止了SH-SY5Y細(xì)胞自噬性死亡[8]。海藻糖通過保護(hù)蛋白酶體的活性抑制SH-SY5Y細(xì)胞免受OGD誘導(dǎo)的自噬損傷[9]。盡管越來越多的證據(jù)表明自噬與缺血性腦卒中、頭部損傷及短暫性腦缺血引發(fā)的腦損傷病理過程有關(guān)[10～12]，但對于死亡性自噬的具體機(jī)制并未完全闡明，考慮到自噬性死亡是導(dǎo)致神經(jīng)元缺血性損傷的一種途徑[9]，本研究將引用自噬流這一概念，應(yīng)用siRNA技術(shù)體外模擬腦缺血引起的神經(jīng)元損傷來進(jìn)一步闡述自噬的具體機(jī)制，從而為臨床上減輕缺血性腦損傷提供了一個(gè)新的理論依據(jù)。SH-SY5Y細(xì)胞是人源多巴胺能神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，在形態(tài)學(xué)、神經(jīng)化學(xué)和電生理學(xué)特性方面與神經(jīng)元極為相似，并已被廣泛應(yīng)用于評估神經(jīng)退行性疾病，腦缺血/再灌注及癲癇引起的神經(jīng)元損傷或死亡[13]。

1 資料與方法

1.1 試劑 3MA(3-甲基腺嘌呤)(selleck公司 美國)，細(xì)胞缺氧培養(yǎng)裝置(比盧普斯羅森堡公司，美國)，MTT購買(碧云天，中國)，小RNA干擾 ULK1(siRNA ULK1)(吉瑪基因 中國上海)。stubRFP-sensGFP-LC3 Lentivirus試劑(吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司 中國上海)，抗P-ULK1抗體、抗ULK1抗體、抗Beclin1抗體(CST公司 美國)、抗LC3抗體(sigma公司 美國)、抗P62抗體(abcam公司 美國)、β-actin抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞獲自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所(中國上海)。細(xì)胞培養(yǎng)使用10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的DMEM中培養(yǎng)，并置于在37 ℃和5% CO2潮濕的孵箱中，每周更換培養(yǎng)基兩次。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞生存率 將對數(shù)期生長的SH-SY5Y細(xì)胞以每孔(4～5)×103接種到96孔板中，待細(xì)胞貼壁后依次加入不同的抑制劑并進(jìn)行OGD相關(guān)處理。于每孔加入20 μl的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，搖勻并使用于酶標(biāo)儀設(shè)置參數(shù)為OD 490 nm處讀取每個(gè)樣品的吸光度值。計(jì)算細(xì)胞存活率公式：細(xì)胞存活率%=樣品組吸光度/對照組吸光度×100%。

1.4 使用SiRAN沉默ULK1基因 將對數(shù)期生長的SH-SY5Y細(xì)胞(1×104)接種到6孔板中。待次日細(xì)胞完全貼壁，更換為無雙抗、無血清的培養(yǎng)基饑餓處理6 h，再使用已配置好的Lipofectamine 3000(Invitrogen，USA)、siRNA ULK1轉(zhuǎn)染試劑處理48 h，隨后將細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪24 h并用于隨后的實(shí)驗(yàn)。

siRNA序列信息為：

ULK1-homo-511：-GGUACCACCAGAGCAACAU-

TT-(5’-3’)

Negative Control：-AUGUUGCUCGGGAGGGACCTT-(5’-3’)

1.5 慢病毒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞 選擇狀態(tài)良好的SH-SY5Y細(xì)胞，嚴(yán)格遵循試劑說明書將密度為(3～5)×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液種植于2.5 cm的培養(yǎng)皿中，置于細(xì)胞孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。參考說明書中的體積更換培養(yǎng)基并加入相應(yīng)感染增強(qiáng)液，將細(xì)胞置于37 ℃孵箱中培育12～16 h后，常規(guī)培養(yǎng)。依據(jù)漢恒生物慢病毒stubRFP-sensGFP-LC3 Lentivirus使用說明，LC3綠色熒光對于酸性環(huán)境下具有不穩(wěn)定性，在自噬體與溶酶體融合后，在溶酶體內(nèi)的酸性水解酶作用下，LC3綠色熒光發(fā)生淬滅，LC3紅色熒光存在。檢測自噬流開放通過觀察同一個(gè)細(xì)胞紅色熒光多于綠色熒光來證明。

1.6 氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?將對數(shù)期生長的細(xì)胞7×103接種到96孔板中，于次日對已貼壁的細(xì)胞更換為無血清，無糖培養(yǎng)基，然后，放入缺氧培養(yǎng)裝置中并充入已配好的5%CO2和95%N2組成的混合氣體，并置于37 ℃的恒溫孵箱中24 h。

1.7 Western blotting法檢測各組細(xì)胞中相關(guān)蛋白的變化 使用1500r/min收集各組細(xì)胞，并使用PBS清洗兩次，依照細(xì)胞的數(shù)量加入細(xì)胞裂解液于冰上裂解0.5 h，使用BCA法測量并調(diào)平蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液100 ℃煮沸10 min并于4 ℃保存。將等量的蛋白質(zhì)在8%聚丙烯酰胺(SDS)凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，Billerica，MA，美國)，并與5%的脫脂奶粉于室溫孵育2 h，剪切相應(yīng)的蛋白條帶孵育抗LC3(1∶1000)、抗ULK1(1∶1000)、抗P-ULK1(1∶1000)于4 ℃冰箱過夜，次日，PBST洗滌3次，每次10 min，然后將免疫印跡膜與辣根過氧化物酶綴合的抗小鼠(1∶2000)或抗兔IgG(1∶2000)在室溫下孵育2 h。最后使用ECL進(jìn)行曝光顯影。使用Image J進(jìn)行灰度分析，灰度結(jié)果=目的蛋白灰度/β-actin。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下各組SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化與特征 與正常對照組細(xì)胞相比，正常實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞無明顯差異，生長良好，形態(tài)成類三角型。與正常對照組相比，OGD對照組的細(xì)胞大部分變圓，細(xì)胞觸角消失。與OGD對照組相比，OGD實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞狀態(tài)略好，部分細(xì)胞變圓，部分細(xì)胞處于正常形態(tài)(見圖1)。

2.1.1 各組SH-SY5Y細(xì)胞存活率 與正常對照組(100%)相比，正常實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率為(0.98±0.01)(P<0.01)。OGD對照組的細(xì)胞存活率為(0.55±0.03)(P<0.01)。OGD實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率為(0.67±0.02)(P<0.01)(見圖2)。

2.1.2 各組SH-SY5Y細(xì)胞中ULK1、P-ULK1、Beclin1、LC3、和P62蛋白表達(dá)水平 與正常對照組相比，正常實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中P-ULK1、Beclin1、LC3、和P62蛋白均未見明顯變化(P<0.01)，其余各組中ULK1蛋白水平均未見顯著變化(P<0.01)。與正常對照組相比，OGD對照組細(xì)胞中P-ULK1、Beclin1、LC3蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，P62蛋白水平降低(P<0.01)。與OGD對照組相比，OGD實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中P-ULK1、Beclin1、LC3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，P62蛋白水平升高(P<0.01)(見圖3)。

A：Normal control group；B：3 mmol/L，3MA group；C：OGD group；D：：3 mmol/L，3MA+OGD group

圖1 各組SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(×20)

2)P<0.01 compared with control group；3)P<0.01 compared with control group；4)P<0.01 compared with OGD group

圖2 MTT檢測各組細(xì)胞存活率

Lane 1：coutrol group；Lane 2：3 mmol/L，3MA group；Lane 3：OGD group；Lane 4：3 mmol/L，3MA+OGD group

2)P<0.01 compared with control group；3)P<0.01 compared with control group；4)P<0.01 compared with OGD group

圖3 各組細(xì)胞中P-ULK1、ULK1、Beclin1、LC3、和P62蛋白表達(dá)電泳圖

2.2 應(yīng)用慢病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察同一細(xì)胞內(nèi)LC3紅綠熒光蛋白數(shù)量差異變化 與OGD處理0 h組細(xì)胞中紅色熒光個(gè)數(shù)(0±1)相比，OGD處理0 h組的細(xì)胞中綠熒光蛋白數(shù)量(0±1)(P<0.01)無明顯差異。與OGD處理6 h組細(xì)胞中紅色熒光個(gè)數(shù)(3±5)相比，OGD處理6 h組的細(xì)胞中綠熒光蛋白數(shù)量(3±5)(P<0.05)無顯著差異。與OGD處理12 h組細(xì)胞中紅色熒光個(gè)數(shù)(12±17)相比，OGD處理12 h組的細(xì)胞中綠熒光蛋白數(shù)量(12±18)(P<0.05)無顯著差異。與OGD處理24 h組細(xì)胞中紅色熒光個(gè)數(shù)(23±27)相比，OGD處理24 h組的細(xì)胞中綠熒光蛋白數(shù)量(7±9)(P<0.05)顯著降低(見圖4)。

2.3 檢測各組細(xì)胞的存活率 與空轉(zhuǎn)組(100%)相比，scrambled組細(xì)胞存活率為(0.98±0.01)(P<0.01)。ULK1 SiRNA組細(xì)胞存活率為(0.96±0.02)(P<0.01)。OGD的空轉(zhuǎn)組細(xì)胞存活率為(0.55±0.03)(P<0.01)。OGD的scrambled組細(xì)胞存活率為(0.54±0.04)(P<0.05)。OGD的ULK1 SiRNA組細(xì)胞存活率為(0.64±0.03)(P<0.01)(見圖5)。

2.3.1 各組SH-SY5Y細(xì)胞中UKL1、P-ULK1、Beclin1、LC3、和P62蛋白表達(dá)水平 與ULK1 SiRNA組的ULK1、p-ULK1蛋白相比，空轉(zhuǎn)組和Scrambled SiRNA組的細(xì)胞中ULK1、P-ULK1蛋白水平均明顯升高(P<0.01)。與OGD的ULK1 SiRNA組ULK1、P-ULK1蛋白相比，OGD的空轉(zhuǎn)組和OGD的Scrambled SiRNA組中ULK1、P-ULK1蛋白水平均顯著升高(P<0.01)。與ULK1 SiRNA組的LC3、beclin-1、P62蛋白相比，Scrambled SiRNA組和空轉(zhuǎn)組的LC3、beclin-1、與P62蛋白均未見明顯變化(P<0.01)。與OGD的SiRNA ULK1組細(xì)胞LC3、beclin-1、與P62蛋白相比，OGD的空轉(zhuǎn)組和OGD的Scrambled SiRNA組細(xì)胞中LC3、beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著增高(P<0.01)，P62蛋白水平明顯下降(P<0.01)(見圖6)。

A：OGD treatment 0 h；B：OGD treatment 6 h；C：OGD treatment 12 h；D：OGD treatment 24 h

A)P<0.01；B)P<0.05；C)P<0.05 red fluorescence compared with green fluorescence；D)P<0.05 red fluorescence compared with green fluorescence

圖4 使用熒光顯微鏡觀察0 h、6 h、12 h和24 h后細(xì)胞中LC3紅綠熒光蛋白差異

2)P<0.01，3)P<0.01，4)P<0.01，6)P<0.01 compared with control group；5)P<0.05 compared with control group

圖5 MTT檢測各組細(xì)胞存活率

Lane 1：coutrol group；Lane 2：Scambled SiRNA group；Lane 3：ULK1 SiRNA group；Lane 4：OGD group；Lane 5：OGD+Scambled SiRNA group；Lane 6：OGD+ULK1 SiRNA group

1)P<0.01；2)P<0.01 compared with SiRNA ULK1 group；4)P<0.01，5)P<0.01 compared with OGD SiRNA ULK1 group

圖6 各組細(xì)胞中P-ULK1、ULK1、Beclin1、LC3、和P62蛋白表達(dá)電泳圖

3 討 論

自噬是一種高度保守的蛋白質(zhì)/細(xì)胞器降解系統(tǒng)，負(fù)責(zé)長期存活的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換和處理多余或受損的細(xì)胞器，以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[14，15]。本研究通過對SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行OGD作用24 h發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞死亡率顯著升高，細(xì)胞中的P-ULK1、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)水平顯著升高，P62蛋白水平下降，應(yīng)用3MA自噬抑制劑可以降低細(xì)胞的死亡率以及P-ULK1、Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)水平，挽救了自噬底物蛋白P62的下降。這說明OGD誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬水平增強(qiáng)，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

ULK1作為自噬途徑的起始蛋白，激活自噬起始復(fù)合體，并參與自噬膜的延伸，最終形成成熟的自噬體。研究表明，ULK1在自噬過程中參與多種機(jī)制的調(diào)節(jié)，如白藜蘆醇通過激活A(yù)MPK/ULK1途徑和下調(diào)mTOR1位點(diǎn)，誘導(dǎo)自噬維持MESC的多能性[16]。ESCs通過依賴AMPK提高ULK1的磷酸化增強(qiáng)自噬水平，平衡能量與生物合成需求，促進(jìn)細(xì)胞復(fù)制和自我更新[17]。ULK1蛋白水平可以通過多種刺激進(jìn)行調(diào)節(jié)，如營養(yǎng)耗竭、能量缺乏和缺氧等[18～20]。在營養(yǎng)缺乏的初始階段，ULK1蛋白即可被誘導(dǎo)并提高轉(zhuǎn)錄水平，而ULK1蛋白主要是通過泛素化蛋白酶體途徑進(jìn)行降解的[21，22]。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，OGD可以顯著誘導(dǎo)并降低SH-SY5Y細(xì)胞蛋白酶體的活性[9]，ULK1蛋白的持續(xù)積累，導(dǎo)致自噬過程持續(xù)存在。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ULK1基因沉默后，顯著降低OGD誘導(dǎo)的P-ULK1、Beclin1、LC3蛋白在SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)。升高P62蛋白的表達(dá)水平；同時(shí)能顯著降低OGD誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的死亡率。結(jié)果表明沉默ULK1基因降低自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制自噬過程減少了OGD所致SH-SY5Y細(xì)胞的死亡。使用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染慢病毒的SH-SY5Y細(xì)胞，隨著OGD處理的時(shí)間逐漸延長，細(xì)胞中紅色熒光蛋白LC3在0 h、6 h、12 h、24 h表達(dá)明顯增多，綠色熒光蛋白在OGD處理0 h、6 h、12 h之前是逐漸增加的，而在24 h時(shí)，綠色熒光蛋白數(shù)量淬滅。根據(jù)紅綠熒光的不同可以發(fā)現(xiàn)OGD作用24 h可能誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬流開放，導(dǎo)致細(xì)胞過度的自我降解，觸發(fā)了非凋亡的程序性死亡(即自噬性死亡)。

綜上所述，OGD可以誘導(dǎo)SH-Y5Y細(xì)胞自噬，并最終誘導(dǎo)自噬流開放引起過度自噬，敲除ULK1基因或應(yīng)用自噬抑制劑可以降低細(xì)胞內(nèi)的自噬水平進(jìn)而阻斷細(xì)胞自噬性死亡。這為臨床上通過抑制自噬過程治療腦缺血性神經(jīng)損傷提供實(shí)驗(yàn)支持，為減緩腦神經(jīng)缺血損傷提供一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。