王 彤，李貞華，張園芳，王 祎，張黔玲，師紅東

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種漸進(jìn)性發(fā)展致死性神經(jīng)退行性疾病。隨著我國人口老化，患AD的人數(shù)不斷增加，對(duì)老年人的身心健康、社會(huì)和家庭造成了嚴(yán)重的影響和負(fù)擔(dān)[1]。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其主要病理機(jī)制學(xué)說有β淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)學(xué)說、tau蛋白學(xué)說、中樞膽堿能損傷學(xué)說、興奮谷氨酸毒性學(xué)說等[2～4]。目前被較多認(rèn)可的是β淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)學(xué)說(amyloid cascade hypothesis)，其觀點(diǎn)是β-淀粉樣肽(amyloid peptide，Aβ肽)在腦部組織中聚集形成沉淀或纖維化，從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[5，6]。因此，抑制Aβ單體發(fā)生錯(cuò)誤折疊或聚集有望減緩AD的發(fā)生發(fā)展。

目前已報(bào)道的Aβ抑制劑主要包括過渡金屬配合物、短肽、有機(jī)分子、多金屬氧酸鹽、納米粒子以及配體功能化量子點(diǎn)等[7～10]。2008年，含鄰菲羅啉或其衍生物的鉑配合物(Pt LCl2)被報(bào)道能夠抑制Aβ聚集，由此開啟了過渡金屬配合物作為Aβ抑制劑的研究。這些鉑配合物通過共價(jià)鍵與Aβ中的金屬結(jié)合位點(diǎn)(His-6、-13，-14)結(jié)合，配合物中的平面芳香環(huán)鄰菲羅啉配體與Aβ的N端疏水區(qū)域發(fā)生疏水作用，從而能夠有效地抑制Aβ42的聚集并降低神經(jīng)毒性。后來，釕、銥、銠等過渡金屬配合物也被研究用于抗AD治療[11～13]。在這些過渡金屬配合物中，釕配合物具有優(yōu)良的化學(xué)穩(wěn)定性和獨(dú)特的光物理、電化學(xué)性質(zhì)，并且毒性較低。此外，釕配合物一般具有6配位八面體構(gòu)型，配合物中的配體可以任意改變，這樣可以使其結(jié)構(gòu)具有多樣性，滿足不同性能的設(shè)計(jì)要求，因此，釕配合物非常適合用于抑制Aβ聚集的研究[14]。本論文中選擇了兩種在不同位置具有雙羥基取代基的結(jié)構(gòu)相似的多吡啶釕配合物Ru[(phen)2(DHOPIP)]2+(p23OH)和Ru[(phen)2(DHMPIP)]2+(p25OH)，通過ThT熒光、TEM、AFM、MTT等方法研究了這兩種釕配合物對(duì)Aβ42纖維化的抑制，探討了羥基取代基位置不同所引起的性質(zhì)差異，為釕配合物作為Aβ抑制劑的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 PC12(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株來源于深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于5%二氧化碳的37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。胰蛋白酶(Biosharp)；磷鎢酸(麥克林，上海)；噻唑藍(lán)(MTT，sigma-Aldrich，美國)，5 mg/ml 4 MTT溶液配制：在凈化工作臺(tái)中，將0.2500 g 噻唑藍(lán)固體粉末溶解于50 ml無菌PBS緩沖液中，并用0.22 μmol/L 的濾膜過濾。分裝于1.5 ml EP管中，封口并避光保存于-20 ℃冰箱中，避免反復(fù)凍融；DMEM完全培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；胎牛血清(FBS，維特森公司，澳洲)；雙抗(青霉素-鏈霉素，Gibico，美國)；磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L PBS，Hyclone，美國)；硫黃素T(ThT，sigma-Aldrich，美國)，1 mmol/L硫黃素T：用毫克天平秤取3.189 mg硫黃素T固體粉末于15 ml離心管中，并用10 ml無菌PBS溶解，避光保存于4 ℃冰箱中；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 配合物的合成 基于已報(bào)道的過渡金屬配合物抑制Aβ42的研究，本論文以毒副作用較低的釕作為金屬中心，以具有芳香環(huán)的鄰菲羅啉(phen)及2-苯基咪唑并[5，6-f]-1，10鄰菲羅啉(PIP)為配體，并在PIP配體上的不同位置上增加了兩個(gè)羥基，合成了兩種結(jié)構(gòu)相似的釕配合物Ru[(phen)2(DHOPIP)]2+(p23OH)和Ru[(phen)2(DHMPIP)]2+(p25OH)，配合物的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 p23OH和p25OH的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.2.2 釕配合物的光譜性質(zhì)研究 采用紫外可見吸收光譜和熒光光譜研究了兩種釕配合物Ru 1和Ru 2的光譜學(xué)性質(zhì)。配合物的濃度為5 μmol/L，使用島津紫外分光光度計(jì)(UV-2450)進(jìn)行紫外光譜表征，掃描波長為200～700 nm，掃描數(shù)據(jù)采取間隔為0.2 nm；使用日立熒光發(fā)射光譜儀(F7000)進(jìn)行熒光光譜表征，配合物的激發(fā)波長為450 nm，掃描速度為1200 nm/min，發(fā)射和吸收光譜狹縫寬為5 nm，PMT Voltage為500。

1.2.3 PC12細(xì)胞培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞放在含有89%DMEM、10% FBS和1%雙抗的培養(yǎng)液中，并置于37 ℃、飽和濕度為5% CO2的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿時(shí)，用0.25%的胰酶將細(xì)胞消化后，加入培養(yǎng)液吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞密度約為5×106，吸取900 μl細(xì)胞懸浮液于2 ml凍存管中并加入100 μl DMSO，輕輕吹打均勻并封口后進(jìn)行程序性降溫：4 ℃存放30 min，-20 ℃存放2 h，最后置于-80 ℃冰箱中凍存進(jìn)行保種。復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，將細(xì)胞從-80 ℃取出后置于37 ℃水浴鍋至融化，于超凈臺(tái)中將含有細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至1.5 ml 離心管中，用封口膜封住。1000 r/min離心5 min后在超凈臺(tái)中吸除上清液，加入1 ml培養(yǎng)液吹打均勻后轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中并另外加入4 ml培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性 收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度約為2×104/ml)，將細(xì)胞接種于透明96孔板(每孔約5×103個(gè)細(xì)胞)，邊緣孔用無菌PBS緩沖液填充，每孔總體積均為100 μl。設(shè)置調(diào)零孔、對(duì)照孔及加藥孔。空白孔為培養(yǎng)液、對(duì)照孔及加藥孔為細(xì)胞懸浮液，并置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，對(duì)加藥孔進(jìn)行加藥，并設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。在終止培養(yǎng)前4 h，向每孔加入15 μl MTT溶液(5 mg/ml)。終止培養(yǎng)時(shí)，小心吸除孔內(nèi)培養(yǎng)液，向每孔加入150 μl DMSO，并置于搖床低速振蕩10 min。最后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD為570 nm處測(cè)量各孔的吸光值。細(xì)胞活性計(jì)算公式為：

1.2.5 Aβ42預(yù)處理 將2.5 mg Aβ42溶于550 μl冷卻的六氟異丙醇(HFIP)中，充分震蕩后，置于4 ℃搖床中搖晃6 h，使Aβ42充分溶解(單體形態(tài))，均等分裝于5個(gè)EP管中，在-80 ℃冰箱中保存。使用前從-80 ℃冰箱取出至冰上溶解后，于冰水浴中超聲2×10 min，并在通風(fēng)櫥中于冰上將EP管蓋打開，用流速較小的N2吹干，使HFIP充分揮發(fā)，管壁內(nèi)形成透明的Aβ42蛋白膜。再加入55 μl DMSO充分震蕩后于16 ℃水浴中超聲10 min，制備成2 mmol/L的Aβ42單體溶液，并根據(jù)需要用10 mmol/L PBS(pH 7.4)稀釋至所需濃度。

1.2.6 ThT熒光實(shí)驗(yàn) ThT廣泛用于Aβ42聚集動(dòng)力學(xué)的監(jiān)測(cè)。取黑色96孔板，設(shè)置好對(duì)照孔、加藥孔、背景孔(不加Aβ42)，并設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，每孔總體積為150 μl，Aβ42加入后即刻于多功能全波長酶標(biāo)儀檢測(cè)485 nm處熒光值(激發(fā)光波長為445 nm)。固定Aβ42終濃度為20 μmol/L，通過改變體系中釕配合物的終濃度(2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L)，研究釕配合物對(duì)Aβ42聚集的影響及釕配合物與Aβ42的作用過程。

1.2.7 原子力顯微鏡(AFM) 將孵育24 h后的Aβ42及Aβ42-配合物的孵育液(各物質(zhì)濃度均為20 μmol/L)均稀釋至1 μmol/L，移取5 μl稀釋液均勻滴于新鮮剝離的云母片上，靜置5 min后用二次蒸餾水輕輕洗滌2次并置于干燥皿中干燥過夜，最后使用原子力顯微鏡進(jìn)行觀察，掃描模式為tapping mode。

1.2.8 透射電鏡(TEM) 移取10 μl孵育24 h后的孵育液(各物質(zhì)濃度均為20 μmol/L)滴于普通微柵支持膜上，靜置20 min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸干，滴加10 μl 1.5%的磷鎢酸(pH 7.4)，靜置10 min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸干，并置于干燥皿中干燥。最后使用透射電鏡對(duì)樣品進(jìn)行觀察，操作電壓為80 kV。

1.2.9 可溶性Aβ42含量測(cè)定 配制釕配合物Aβ42濃度均為20 μmol/L 的孵育液在37 ℃進(jìn)行孵育，并設(shè)置對(duì)照組。取不同時(shí)間段(6 h、24 h、48 h、96 h)的孵育液進(jìn)行13800 r/min離心20 min，取上清液進(jìn)行BCA蛋白定量，每個(gè)樣平行4個(gè)復(fù)孔。

1.2.10 Aβ42內(nèi)部熒光滴定實(shí)驗(yàn) 配制終濃度為22 μmol/L 的Aβ42單體溶液700 μl，PBS為緩沖液體系，于熒光發(fā)射光譜儀記錄270 nm激發(fā)下的發(fā)射光譜(290～380 nm)，設(shè)定掃描速度為1200 nm/min，發(fā)射和吸收光譜狹縫寬為5 nm，PMT Voltage為500。并隨后逐次加入5 μl釕配合物、混勻并放置1 min，直至體系熒光幾乎不再變化。計(jì)算配合物與Aβ42的淬滅常數(shù)、表觀結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 p23OH和p25OH的光譜性質(zhì)表征 p23OH和p25OH的紫外吸收光譜圖和熒光發(fā)射光譜圖比較相似(見圖2)，均在262 nm處有一個(gè)IL(Interligand)峰，在450 nm處有一個(gè)MLCT(Metal Ligand Charge Transfer)峰；在450 nm光激發(fā)下，兩個(gè)釕配合物均在579 nm處出現(xiàn)最大發(fā)射峰。

2.2 p23OH和p25OH能夠抑制Aβ42聚集 設(shè)定Aβ42的終濃度為20 μmol/L，改變配合物的濃度，采用ThT熒光法研究不同濃度的兩種配合物對(duì)Aβ42聚集的影響(見圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與釕配合物共同孵育后，在前200 min內(nèi)，Aβ42體系中ThT的熒光強(qiáng)度迅速增加，并在約300 min時(shí)ThT熒光值達(dá)到最大，然后基本保持穩(wěn)定不變。隨著配合物濃度的增加，相同時(shí)間下ThT的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。改變釕配合物的濃度分別為2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、和30 μmol/L，與Aβ42共同孵育24 h后，p23OH對(duì)Aβ42纖維體形成的抑制率分別位46.49%、58.96%、76.53%、91.35%、96.00%；p25OH對(duì)Aβ42纖維體形成的抑制率分別22.54%、27.48%、48.97%、78.79%、84.40%?？梢?，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，p23OH抑制Aβ42聚集的能力明顯高于p25OH。

2.3 p23OH和p25OH抑制Aβ42聚集的形貌觀察 采用AFM和TEM研究了釕配合物對(duì)Aβ42聚集的影響(見圖4)。從AFM實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以明顯看出，在沒有釕配合物的存在下，Aβ42形成了密集的分支狀纖維體，形成明顯的纖維狀網(wǎng)絡(luò)。而在p23OH或p25OH配合物存在時(shí)，體系中觀察不到纖維狀的Aβ42，主要以一些小顆粒存在，猜測(cè)為小分子量的寡聚體，且顆粒分子相對(duì)較少。TEM的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也可以看出，在沒有釕配合物的存在下，Aβ42形成了明顯的聚集體，而在釕配合物存在下，只有分散的顆粒存在。這些結(jié)果說明釕配合物可以有效地抑制Aβ42聚集。

2.4 可溶性蛋白含量的測(cè)定 纖維化的Aβ蛋白或高分子量的Aβ寡聚體容易被高速離心沉淀下來，而可溶性的Aβ單體及低分子量寡聚體則會(huì)存留在上清液中。因此，本論文通過BCA蛋白定量法，取不同時(shí)間段(6 h、24 h、48 h、96 h、120 h)的37 ℃孵育液(配合物、Aβ42濃度均為20 μmol/L)在13800 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，取上清液測(cè)試，確定體系中可溶性蛋白的含量，從而評(píng)估不同孵育體系中Aβ的聚集程度(見圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著孵育時(shí)間延長，各體系中可溶性蛋白的含量逐漸降低；相對(duì)于沒有加入釕配合物的Aβ42體系，加了釕配合物的孵育液體系中可溶性蛋白的含量明顯較高，且加了p23OH體系中的可溶性蛋白的含量稍高于加了p25OH體系。進(jìn)一步延長孵育時(shí)間，所有體系中的可溶性蛋白含量都明顯降低，這是由于Aβ本身具有較強(qiáng)的疏水性質(zhì)，從而引起沉淀所致。

2.5 p23OH和p25OH降低Aβ42聚集導(dǎo)致的細(xì)胞毒性 為定性評(píng)估兩種釕配合物的細(xì)胞毒性，我們采用MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)法，通過設(shè)置一系列釕配合物的濃度(2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)，使其與PC12細(xì)胞共孵育24 h后，檢測(cè)其細(xì)胞活性(見圖6A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種釕配合物均具有較低的細(xì)胞毒性，且p23OH的細(xì)胞毒性小于p25OH。配合物的細(xì)胞毒性與其濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，其IC50分別為38.5 μmol/L 和28.5 μmol/L 。我們還做了配合物對(duì)Aβ42細(xì)胞毒性影響的研究。由于有大量研究表明金屬離子，尤其Zn2+、Cu2+和Fe3+與Aβ聚集有密切關(guān)系，且可能增強(qiáng)Aβ的細(xì)胞毒性，因此我們研究在Cu2+存在下，有無p23OH或p25OH的情況下對(duì)Aβ42聚集導(dǎo)致的細(xì)胞毒性的影響(見圖6B)，Cu2+加入對(duì)Aβ42導(dǎo)致的細(xì)胞毒性影響較?。浑m然p23OH和p25OH在10 μmol/L 下對(duì)細(xì)胞的抑制率約有80%，但加入p23OH或p25OH后，明顯減少了Aβ42纖維化導(dǎo)致的細(xì)胞毒性，且p23OH作用比p25OH大，這一結(jié)果跟p23OH抑制Aβ42纖維化效果比p25OH好一致。說明p23OH和p25OH能夠降低Aβ42聚集導(dǎo)致的細(xì)胞毒性。

2.6 Aβ42內(nèi)部熒光滴定實(shí)驗(yàn) 含有芳香環(huán)的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸具有自身熒光性質(zhì)，因此含有酪氨酸殘基的Aβ42多肽具有自發(fā)熒光性質(zhì)，在270 nm光激發(fā)下，在290～380 nm范圍內(nèi)有熒光出現(xiàn)。當(dāng)Aβ42與其它分子發(fā)生相互作用時(shí)會(huì)使自身熒光降低，熒光強(qiáng)度降低越明顯，說明相互作用越強(qiáng)。向Aβ42體系中逐漸滴加釕配合物，研究了釕配合物與Aβ42的相互作用。設(shè)定激發(fā)波長為274 nm，向含20μmol/L 的Aβ42體系中逐步滴加釕配合物，隨著釕配合物濃度的增大，體系的熒光強(qiáng)度逐漸下降(見圖7)。采用Stern-Volmer動(dòng)態(tài)熒光淬滅方程[15，16]：F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q](F0和F分別表示有無淬滅劑時(shí)體系的熒光強(qiáng)度，Kq為熒光淬滅速率，τ0為熒光分子的熒光壽命，大多數(shù)生物分子的熒光壽命可認(rèn)為是10-8s；KSV為熒光淬滅常數(shù)；[Q]為體系中淬滅劑的濃度)。對(duì)配合物與Aβ42間的淬滅方式進(jìn)行表征，從(F0/F-1)-[Q]圖中各數(shù)據(jù)點(diǎn)可以看出，Stern-Volmer曲線分成兩段線性區(qū)間，說明釕配合物與Aβ42之間同時(shí)存在著動(dòng)態(tài)熒光淬滅和靜態(tài)熒光淬滅兩種淬滅方式。且隨著配合物濃度增加，Stern-Volmer曲線向y軸靠近，說明隨著配合物濃度的增加，配合物對(duì)Aβ42的熒光淬滅愈加趨向于動(dòng)態(tài)淬滅。以體系中釕配合物與Aβ42的濃度比([Ru]/[Aβ42])為0.3611作為分界點(diǎn)，對(duì)Stern-Volmer曲線進(jìn)行分段線性擬合并求出各自相對(duì)應(yīng)的Kq、KSV和R2(相關(guān)系數(shù)的平方)(見圖7、表1)。由于兩種釕配合物使Aβ42內(nèi)部熒光淬滅的淬滅速率均大于2×1010，因此，p23OH和p25OH兩種配合物使Aβ42熒光淬滅的方式主要為靜態(tài)熒光淬滅。但是隨著釕配合物濃度的增加，動(dòng)態(tài)淬滅的效果逐漸增強(qiáng)。釕配合物對(duì)Aβ42的靜態(tài)淬滅可利用公式log(F0/F-1)= logK+nlog[Qt](K：表觀結(jié)合常數(shù)；n：結(jié)合位點(diǎn)數(shù))來計(jì)算淬滅劑與熒光分子間的表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(見圖8)，兩種釕配合物與Aβ42的log(F0/F-1)- log[Qt]曲線具有很好的線性相關(guān)，具體的線性方程及所求得的表觀結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n見表2。從表中可見，兩種釕配合物和Aβ42的表觀結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)都比較接近，且表觀結(jié)合常數(shù)都小于0.08 mol/L。說明兩種釕配合物與Aβ42的相互作用較弱，主要以非共價(jià)作用形成復(fù)合物，如靜電作用、疏水作用和氫鍵作用等。

圖2 Ru[(phen)2(DHOPIP)]2+和 Ru[(phen)2(DHMPIP)]2+的紫外吸收光譜圖(A)及熒光發(fā)射光譜圖(B)

圖3 p23OH和p25OH配合物對(duì)Aβ42聚集的抑制動(dòng)力學(xué)(Aβ42及ThT均為20 μmol/L，[Ru] = 2 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L)

圖4 TEM和AFM檢測(cè)p23OH和p25OH配合物對(duì)Aβ42聚集的影響([Aβ42] = 20 μmol/L，[Ru] = 20 μmol/L)

圖5 釕配合物與Aβ42共同孵育不同時(shí)間段的可溶性蛋白含量

圖6 A：不同濃度的p23OH或p25OH作用于PC12細(xì)胞24 h后的細(xì)胞活性；B：Aβ42在有無Cu2+及釕配合物存在下對(duì)PC12的細(xì)胞毒性的影響

圖7 釕配合物與Aβ42的熒光滴定譜圖及Stern-Volmer方程的分段線性擬合

圖8 靜態(tài)熒光淬滅線性擬合

表1 Stern-Volmer方程分段線性擬合得到的熒光淬滅速率及淬滅常數(shù)

表2 配合物與Aβ42的表觀結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

3 討 論

隨著人類壽命的增加，特別是我國人口老齡化的加劇，AD嚴(yán)重影響著我國人民的生命健康和生活質(zhì)量。目前所使用的抗AD藥物都只能起到緩解病情的作用，不能根治。因此，開發(fā)出能夠有效預(yù)防AD的藥物極為迫切?；讦?淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)學(xué)說，研發(fā)對(duì)Aβ聚集能夠起到調(diào)控作用的Aβ調(diào)節(jié)劑是防治AD的有效策略，也是當(dāng)今熱門的研究課題。其中，Aβ調(diào)節(jié)劑可分為能夠抑制Aβ聚集、對(duì)Aβ聚集體具有解聚作用、能夠?qū)β轉(zhuǎn)變?yōu)榈投揪奂w等類型。近年來，越來越多的過渡金屬配合物被報(bào)道具有抑制Aβ聚集的作用。其中，一些釕配合物被報(bào)道具有良好的抑制Aβ聚集的效果，并且有些釕配合物還同時(shí)具有抑制和監(jiān)測(cè)Aβ聚集的雙功能作用。與其它的金屬配合物相比，釕配合物的毒性較低，是一種潛在的Aβ聚集調(diào)節(jié)劑，有望開發(fā)成為新型的AD藥物。因此，深入開展釕配合物與Aβ的相互作用的研究，對(duì)尋找合適的Aβ聚集調(diào)節(jié)劑具有重要意義。

本論文選取含雙羥基的兩種釕配合物Ru[(phen)2(DHOPIP)]2+(p23OH)和Ru[(phen)2(DHMPIP)]2+(p25OH)，通過ThT熒光、AFM、TEM和可溶性蛋白含量測(cè)定等方法研究了兩種釕配合物對(duì)Aβ42纖維化的抑制效果。在ThT方法中，硫磺素T(ThT)能夠特異性地識(shí)別、結(jié)合具有β片層的Aβ纖維體，從而使自身熒光顯著增強(qiáng)，常用于檢測(cè)Aβ聚集，體系中熒光強(qiáng)度越大，表明Aβ聚集體越多[17，18]，反之熒光強(qiáng)度越低，表明Aβ聚集體越少，所以可以通過ThT熒光方法檢測(cè)釕配合物對(duì)Aβ聚集的影響。結(jié)果顯示兩種釕配合物都能有效的抑制Aβ聚集，并且呈現(xiàn)出劑量關(guān)系，釕配合物的濃度越大，對(duì)Aβ42纖維化的抑制效果就越明顯，而且p23OH抑制Aβ42聚集能力明顯高于p25OH 。同時(shí)AFM和TEM結(jié)果直觀表明在不加釕配合物的時(shí)候，Aβ42自身會(huì)快速聚集成纖維聚集體，而在p23OH和 p25OH存在下，極大地減少了Aβ42纖維化?？扇苄缘鞍缀繙y(cè)定也說明兩種釕配合物能夠有效降低Aβ42聚集，增加Aβ42的溶解性。Aβ在腦組織中聚集形成沉淀或纖維化，而對(duì)中樞神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，造成中樞神經(jīng)損傷，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，p23OH和 p25OH能夠減弱Aβ42纖維化產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。熒光滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，兩種釕配合物使Aβ42熒光淬滅的方式主要為靜態(tài)熒光淬滅。隨著配合物濃度的增加，動(dòng)態(tài)淬滅的效果逐漸增強(qiáng)，靜態(tài)淬滅效果減弱。兩種釕配合物與Aβ42結(jié)合的表觀結(jié)合常數(shù)都小于0.08 mol/L，說明兩種釕配合物與Aβ42的相互作用較弱，主要以非共價(jià)作用形成復(fù)合物，如靜電作用、疏水作用和氫鍵作用等。

綜上所述，本論文中合成的p23OH和 p25OH配合物能夠有效的抑制Aβ纖維化，減弱Aβ42纖維化產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，說明這兩種釕配合物在治療AD方面可能具有潛在的應(yīng)用前景。