王 彤,李貞華,張園芳,王 祎,張黔玲,師紅東
阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一種漸進(jìn)性發(fā)展致死性神經(jīng)退行性疾病。隨著我國人口老化,患AD的人數(shù)不斷增加,對(duì)老年人的身心健康、社會(huì)和家庭造成了嚴(yán)重的影響和負(fù)擔(dān)[1]。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其主要病理機(jī)制學(xué)說有β淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)學(xué)說、tau蛋白學(xué)說、中樞膽堿能損傷學(xué)說、興奮谷氨酸毒性學(xué)說等[2~4]。目前被較多認(rèn)可的是β淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)學(xué)說(amyloid cascade hypothesis),其觀點(diǎn)是β-淀粉樣肽(amyloid peptide,Aβ肽)在腦部組織中聚集形成沉淀或纖維化,從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[5,6]。因此,抑制Aβ單體發(fā)生錯(cuò)誤折疊或聚集有望減緩AD的發(fā)生發(fā)展。
目前已報(bào)道的Aβ抑制劑主要包括過渡金屬配合物、短肽、有機(jī)分子、多金屬氧酸鹽、納米粒子以及配體功能化量子點(diǎn)等[7~10]。2008年,含鄰菲羅啉或其衍生物的鉑配合物(Pt LCl2)被報(bào)道能夠抑制Aβ聚集,由此開啟了過渡金屬配合物作為Aβ抑制劑的研究。這些鉑配合物通過共價(jià)鍵與Aβ中的金屬結(jié)合位點(diǎn)(His-6、-13,-14)結(jié)合,配合物中的平面芳香環(huán)鄰菲羅啉配體與Aβ的N端疏水區(qū)域發(fā)生疏水作用,從而能夠有效地抑制Aβ42的聚集并降低神經(jīng)毒性。后來,釕、銥、銠等過渡金屬配合物也被研究用于抗AD治療[11~13]。在這些過渡金屬配合物中,釕配合物具有優(yōu)良的化學(xué)穩(wěn)定性和獨(dú)特的光物理、電化學(xué)性質(zhì),并且毒性較低。此外,釕配合物一般具有6配位八面體構(gòu)型,配合物中的配體可以任意改變,這樣可以使其結(jié)構(gòu)具有多樣性,滿足不同性能的設(shè)計(jì)要求,因此,釕配合物非常適合用于抑制Aβ聚集的研究[14]。本論文中選擇了兩種在不同位置具有雙羥基取代基的結(jié)構(gòu)相似的多吡啶釕配合物Ru[(phen)2(DHOPIP)]2+(p23OH)和Ru[(phen)2(DHMPIP)]2+(p25OH),通過ThT熒光、TEM、AFM、MTT等方法研究了這兩種釕配合物對(duì)Aβ42纖維化的抑制,探討了羥基取代基位置不同所引起的性質(zhì)差異,為釕配合物作為Aβ抑制劑的研究提供一定的理論依據(jù)。
1.1 細(xì)胞株和主要試劑 PC12(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株來源于深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院),用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),并置于5%二氧化碳的37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。胰蛋白酶(Biosharp);磷鎢酸(麥克林,上海);噻唑藍(lán)(MTT,sigma-Aldrich,美國),5 mg/ml 4 MTT溶液配制:在凈化工作臺(tái)中,將0.2500 g 噻唑藍(lán)固體粉末溶解于50 ml無菌PBS緩沖液中,并用0.22 μmol/L 的濾膜過濾。分裝于1.5 ml EP管中,封口并避光保存于-20 ℃冰箱中,避免反復(fù)凍融;DMEM完全培養(yǎng)基(Hyclone,美國);胎牛血清(FBS,維特森公司,澳洲);雙抗(青霉素-鏈霉素,Gibico,美國);磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L PBS,Hyclone,美國);硫黃素T(ThT,sigma-Aldrich,美國),1 mmol/L硫黃素T:用毫克天平秤取3.189 mg硫黃素T固體粉末于15 ml離心管中,并用10 ml無菌PBS溶解,避光保存于4 ℃冰箱中;
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 配合物的合成 基于已報(bào)道的過渡金屬配合物抑制Aβ42的研究,本論文以毒副作用較低的釕作為金屬中心,以具有芳香環(huán)的鄰菲羅啉(phen)及2-苯基咪唑并[5,6-f]-1,10鄰菲羅啉(PIP)為配體,并在PIP配體上的不同位置上增加了兩個(gè)羥基,合成了兩種結(jié)構(gòu)相似的釕配合物Ru[(phen)2(DHOPIP)]2+(p23OH)和Ru[(phen)2(DHMPIP)]2+(p25OH),配合物的結(jié)構(gòu)見圖1。
圖1 p23OH和p25OH的化學(xué)結(jié)構(gòu)式
1.2.2 釕配合物的光譜性質(zhì)研究 采用紫外可見吸收光譜和熒光光譜研究了兩種釕配合物Ru 1和Ru 2的光譜學(xué)性質(zhì)。配合物的濃度為5 μmol/L,使用島津紫外分光光度計(jì)(UV-2450)進(jìn)行紫外光譜表征,掃描波長為200~700 nm,掃描數(shù)據(jù)采取間隔為0.2 nm;使用日立熒光發(fā)射光譜儀(F7000)進(jìn)行熒光光譜表征,配合物的激發(fā)波長為450 nm,掃描速度為1200 nm/min,發(fā)射和吸收光譜狹縫寬為5 nm,PMT Voltage為500。
1.2.3 PC12細(xì)胞培養(yǎng) 將PC12細(xì)胞放在含有89%DMEM、10% FBS和1%雙抗的培養(yǎng)液中,并置于37 ℃、飽和濕度為5% CO2的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長滿時(shí),用0.25%的胰酶將細(xì)胞消化后,加入培養(yǎng)液吹打均勻,調(diào)整細(xì)胞密度約為5×106,吸取900 μl細(xì)胞懸浮液于2 ml凍存管中并加入100 μl DMSO,輕輕吹打均勻并封口后進(jìn)行程序性降溫:4 ℃存放30 min,-20 ℃存放2 h,最后置于-80 ℃冰箱中凍存進(jìn)行保種。復(fù)蘇細(xì)胞時(shí),將細(xì)胞從-80 ℃取出后置于37 ℃水浴鍋至融化,于超凈臺(tái)中將含有細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至1.5 ml 離心管中,用封口膜封住。1000 r/min離心5 min后在超凈臺(tái)中吸除上清液,加入1 ml培養(yǎng)液吹打均勻后轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中并另外加入4 ml培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。
1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性 收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度約為2×104/ml),將細(xì)胞接種于透明96孔板(每孔約5×103個(gè)細(xì)胞),邊緣孔用無菌PBS緩沖液填充,每孔總體積均為100 μl。設(shè)置調(diào)零孔、對(duì)照孔及加藥孔。空白孔為培養(yǎng)液、對(duì)照孔及加藥孔為細(xì)胞懸浮液,并置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后,對(duì)加藥孔進(jìn)行加藥,并設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。在終止培養(yǎng)前4 h,向每孔加入15 μl MTT溶液(5 mg/ml)。終止培養(yǎng)時(shí),小心吸除孔內(nèi)培養(yǎng)液,向每孔加入150 μl DMSO,并置于搖床低速振蕩10 min。最后,用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD為570 nm處測(cè)量各孔的吸光值。細(xì)胞活性計(jì)算公式為:
1.2.5 Aβ42預(yù)處理 將2.5 mg Aβ42溶于550 μl冷卻的六氟異丙醇(HFIP)中,充分震蕩后,置于4 ℃搖床中搖晃6 h,使Aβ42充分溶解(單體形態(tài)),均等分裝于5個(gè)EP管中,在-80 ℃冰箱中保存。使用前從-80 ℃冰箱取出至冰上溶解后,于冰水浴中超聲2×10 min,并在通風(fēng)櫥中于冰上將EP管蓋打開,用流速較小的N2吹干,使HFIP充分揮發(fā),管壁內(nèi)形成透明的Aβ42蛋白膜。再加入55 μl DMSO充分震蕩后于16 ℃水浴中超聲10 min,制備成2 mmol/L的Aβ42單體溶液,并根據(jù)需要用10 mmol/L PBS(pH 7.4)稀釋至所需濃度。
1.2.6 ThT熒光實(shí)驗(yàn) ThT廣泛用于Aβ42聚集動(dòng)力學(xué)的監(jiān)測(cè)。取黑色96孔板,設(shè)置好對(duì)照孔、加藥孔、背景孔(不加Aβ42),并設(shè)置4個(gè)復(fù)孔,每孔總體積為150 μl,Aβ42加入后即刻于多功能全波長酶標(biāo)儀檢測(cè)485 nm處熒光值(激發(fā)光波長為445 nm)。固定Aβ42終濃度為20 μmol/L,通過改變體系中釕配合物的終濃度(2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L),研究釕配合物對(duì)Aβ42聚集的影響及釕配合物與Aβ42的作用過程。
1.2.7 原子力顯微鏡(AFM) 將孵育24 h后的Aβ42及Aβ42-配合物的孵育液(各物質(zhì)濃度均為20 μmol/L)均稀釋至1 μmol/L,移取5 μl稀釋液均勻滴于新鮮剝離的云母片上,靜置5 min后用二次蒸餾水輕輕洗滌2次并置于干燥皿中干燥過夜,最后使用原子力顯微鏡進(jìn)行觀察,掃描模式為tapping mode。
1.2.8 透射電鏡(TEM) 移取10 μl孵育24 h后的孵育液(各物質(zhì)濃度均為20 μmol/L)滴于普通微柵支持膜上,靜置20 min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸干,滴加10 μl 1.5%的磷鎢酸(pH 7.4),靜置10 min后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸干,并置于干燥皿中干燥。最后使用透射電鏡對(duì)樣品進(jìn)行觀察,操作電壓為80 kV。
1.2.9 可溶性Aβ42含量測(cè)定 配制釕配合物Aβ42濃度均為20 μmol/L 的孵育液在37 ℃進(jìn)行孵育,并設(shè)置對(duì)照組。取不同時(shí)間段(6 h、24 h、48 h、96 h)的孵育液進(jìn)行13800 r/min離心20 min,取上清液進(jìn)行BCA蛋白定量,每個(gè)樣平行4個(gè)復(fù)孔。
1.2.10 Aβ42內(nèi)部熒光滴定實(shí)驗(yàn) 配制終濃度為22 μmol/L 的Aβ42單體溶液700 μl,PBS為緩沖液體系,于熒光發(fā)射光譜儀記錄270 nm激發(fā)下的發(fā)射光譜(290~380 nm),設(shè)定掃描速度為1200 nm/min,發(fā)射和吸收光譜狹縫寬為5 nm,PMT Voltage為500。并隨后逐次加入5 μl釕配合物、混勻并放置1 min,直至體系熒光幾乎不再變化。計(jì)算配合物與Aβ42的淬滅常數(shù)、表觀結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)。
2.1 p23OH和p25OH的光譜性質(zhì)表征 p23OH和p25OH的紫外吸收光譜圖和熒光發(fā)射光譜圖比較相似(見圖2),均在262 nm處有一個(gè)IL(Interligand)峰,在450 nm處有一個(gè)MLCT(Metal Ligand Charge Transfer)峰;在450 nm光激發(fā)下,兩個(gè)釕配合物均在579 nm處出現(xiàn)最大發(fā)射峰。
2.2 p23OH和p25OH能夠抑制Aβ42聚集 設(shè)定Aβ42的終濃度為20 μmol/L,改變配合物的濃度,采用ThT熒光法研究不同濃度的兩種配合物對(duì)Aβ42聚集的影響(見圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與釕配合物共同孵育后,在前200 min內(nèi),Aβ42體系中ThT的熒光強(qiáng)度迅速增加,并在約300 min時(shí)ThT熒光值達(dá)到最大,然后基本保持穩(wěn)定不變。隨著配合物濃度的增加,相同時(shí)間下ThT的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。改變釕配合物的濃度分別為2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、和30 μmol/L,與Aβ42共同孵育24 h后,p23OH對(duì)Aβ42纖維體形成的抑制率分別位46.49%、58.96%、76.53%、91.35%、96.00%;p25OH對(duì)Aβ42纖維體形成的抑制率分別22.54%、27.48%、48.97%、78.79%、84.40%??梢?,在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,p23OH抑制Aβ42聚集的能力明顯高于p25OH。
2.3 p23OH和p25OH抑制Aβ42聚集的形貌觀察 采用AFM和TEM研究了釕配合物對(duì)Aβ42聚集的影響(見圖4)。從AFM實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以明顯看出,在沒有釕配合物的存在下,Aβ42形成了密集的分支狀纖維體,形成明顯的纖維狀網(wǎng)絡(luò)。而在p23OH或p25OH配合物存在時(shí),體系中觀察不到纖維狀的Aβ42,主要以一些小顆粒存在,猜測(cè)為小分子量的寡聚體,且顆粒分子相對(duì)較少。TEM的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也可以看出,在沒有釕配合物的存在下,Aβ42形成了明顯的聚集體,而在釕配合物存在下,只有分散的顆粒存在。這些結(jié)果說明釕配合物可以有效地抑制Aβ42聚集。
2.4 可溶性蛋白含量的測(cè)定 纖維化的Aβ蛋白或高分子量的Aβ寡聚體容易被高速離心沉淀下來,而可溶性的Aβ單體及低分子量寡聚體則會(huì)存留在上清液中。因此,本論文通過BCA蛋白定量法,取不同時(shí)間段(6 h、24 h、48 h、96 h、120 h)的37 ℃孵育液(配合物、Aβ42濃度均為20 μmol/L)在13800 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min,取上清液測(cè)試,確定體系中可溶性蛋白的含量,從而評(píng)估不同孵育體系中Aβ的聚集程度(見圖5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著孵育時(shí)間延長,各體系中可溶性蛋白的含量逐漸降低;相對(duì)于沒有加入釕配合物的Aβ42體系,加了釕配合物的孵育液體系中可溶性蛋白的含量明顯較高,且加了p23OH體系中的可溶性蛋白的含量稍高于加了p25OH體系。進(jìn)一步延長孵育時(shí)間,所有體系中的可溶性蛋白含量都明顯降低,這是由于Aβ本身具有較強(qiáng)的疏水性質(zhì),從而引起沉淀所致。
2.5 p23OH和p25OH降低Aβ42聚集導(dǎo)致的細(xì)胞毒性 為定性評(píng)估兩種釕配合物的細(xì)胞毒性,我們采用MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)法,通過設(shè)置一系列釕配合物的濃度(2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L),使其與PC12細(xì)胞共孵育24 h后,檢測(cè)其細(xì)胞活性(見圖6A)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種釕配合物均具有較低的細(xì)胞毒性,且p23OH的細(xì)胞毒性小于p25OH。配合物的細(xì)胞毒性與其濃度呈現(xiàn)正相關(guān),其IC50分別為38.5 μmol/L 和28.5 μmol/L 。我們還做了配合物對(duì)Aβ42細(xì)胞毒性影響的研究。由于有大量研究表明金屬離子,尤其Zn2+、Cu2+和Fe3+與Aβ聚集有密切關(guān)系,且可能增強(qiáng)Aβ的細(xì)胞毒性,因此我們研究在Cu2+存在下,有無p23OH或p25OH的情況下對(duì)Aβ42聚集導(dǎo)致的細(xì)胞毒性的影響(見圖6B),Cu2+加入對(duì)Aβ42導(dǎo)致的細(xì)胞毒性影響較?。浑m然p23OH和p25OH在10 μmol/L 下對(duì)細(xì)胞的抑制率約有80%,但加入p23OH或p25OH后,明顯減少了Aβ42纖維化導(dǎo)致的細(xì)胞毒性,且p23OH作用比p25OH大,這一結(jié)果跟p23OH抑制Aβ42纖維化效果比p25OH好一致。說明p23OH和p25OH能夠降低Aβ42聚集導(dǎo)致的細(xì)胞毒性。
2.6 Aβ42內(nèi)部熒光滴定實(shí)驗(yàn) 含有芳香環(huán)的色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸具有自身熒光性質(zhì),因此含有酪氨酸殘基的Aβ42多肽具有自發(fā)熒光性質(zhì),在270 nm光激發(fā)下,在290~380 nm范圍內(nèi)有熒光出現(xiàn)。當(dāng)Aβ42與其它分子發(fā)生相互作用時(shí)會(huì)使自身熒光降低,熒光強(qiáng)度降低越明顯,說明相互作用越強(qiáng)。向Aβ42體系中逐漸滴加釕配合物,研究了釕配合物與Aβ42的相互作用。設(shè)定激發(fā)波長為274 nm,向含20μmol/L 的Aβ42體系中逐步滴加釕配合物,隨著釕配合物濃度的增大,體系的熒光強(qiáng)度逐漸下降(見圖7)。采用Stern-Volmer動(dòng)態(tài)熒光淬滅方程[15,16]:F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q](F0和F分別表示有無淬滅劑時(shí)體系的熒光強(qiáng)度,Kq為熒光淬滅速率,τ0為熒光分子的熒光壽命,大多數(shù)生物分子的熒光壽命可認(rèn)為是10-8s;KSV為熒光淬滅常數(shù);[Q]為體系中淬滅劑的濃度)。對(duì)配合物與Aβ42間的淬滅方式進(jìn)行表征,從(F0/F-1)-[Q]圖中各數(shù)據(jù)點(diǎn)可以看出,Stern-Volmer曲線分成兩段線性區(qū)間,說明釕配合物與Aβ42之間同時(shí)存在著動(dòng)態(tài)熒光淬滅和靜態(tài)熒光淬滅兩種淬滅方式。且隨著配合物濃度增加,Stern-Volmer曲線向y軸靠近,說明隨著配合物濃度的增加,配合物對(duì)Aβ42的熒光淬滅愈加趨向于動(dòng)態(tài)淬滅。以體系中釕配合物與Aβ42的濃度比([Ru]/[Aβ42])為0.3611作為分界點(diǎn),對(duì)Stern-Volmer曲線進(jìn)行分段線性擬合并求出各自相對(duì)應(yīng)的Kq、KSV和R2(相關(guān)系數(shù)的平方)(見圖7、表1)。由于兩種釕配合物使Aβ42內(nèi)部熒光淬滅的淬滅速率均大于2×1010,因此,p23OH和p25OH兩種配合物使Aβ42熒光淬滅的方式主要為靜態(tài)熒光淬滅。但是隨著釕配合物濃度的增加,動(dòng)態(tài)淬滅的效果逐漸增強(qiáng)。釕配合物對(duì)Aβ42的靜態(tài)淬滅可利用公式log(F0/F-1)= logK+nlog[Qt](K:表觀結(jié)合常數(shù);n:結(jié)合位點(diǎn)數(shù))來計(jì)算淬滅劑與熒光分子間的表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(見圖8),兩種釕配合物與Aβ42的log(F0/F-1)- log[Qt]曲線具有很好的線性相關(guān),具體的線性方程及所求得的表觀結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n見表2。從表中可見,兩種釕配合物和Aβ42的表觀結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)都比較接近,且表觀結(jié)合常數(shù)都小于0.08 mol/L。說明兩種釕配合物與Aβ42的相互作用較弱,主要以非共價(jià)作用形成復(fù)合物,如靜電作用、疏水作用和氫鍵作用等。
圖2 Ru[(phen)2(DHOPIP)]2+和 Ru[(phen)2(DHMPIP)]2+的紫外吸收光譜圖(A)及熒光發(fā)射光譜圖(B)
圖3 p23OH和p25OH配合物對(duì)Aβ42聚集的抑制動(dòng)力學(xué)(Aβ42及ThT均為20 μmol/L,[Ru] = 2 μmol/L,5 μmol/L,10 μmol/L)
圖4 TEM和AFM檢測(cè)p23OH和p25OH配合物對(duì)Aβ42聚集的影響([Aβ42] = 20 μmol/L,[Ru] = 20 μmol/L)
圖5 釕配合物與Aβ42共同孵育不同時(shí)間段的可溶性蛋白含量
圖6 A:不同濃度的p23OH或p25OH作用于PC12細(xì)胞24 h后的細(xì)胞活性;B:Aβ42在有無Cu2+及釕配合物存在下對(duì)PC12的細(xì)胞毒性的影響
圖7 釕配合物與Aβ42的熒光滴定譜圖及Stern-Volmer方程的分段線性擬合
圖8 靜態(tài)熒光淬滅線性擬合
表1 Stern-Volmer方程分段線性擬合得到的熒光淬滅速率及淬滅常數(shù)
表2 配合物與Aβ42的表觀結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)
隨著人類壽命的增加,特別是我國人口老齡化的加劇,AD嚴(yán)重影響著我國人民的生命健康和生活質(zhì)量。目前所使用的抗AD藥物都只能起到緩解病情的作用,不能根治。因此,開發(fā)出能夠有效預(yù)防AD的藥物極為迫切?;讦?淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)學(xué)說,研發(fā)對(duì)Aβ聚集能夠起到調(diào)控作用的Aβ調(diào)節(jié)劑是防治AD的有效策略,也是當(dāng)今熱門的研究課題。其中,Aβ調(diào)節(jié)劑可分為能夠抑制Aβ聚集、對(duì)Aβ聚集體具有解聚作用、能夠?qū)β轉(zhuǎn)變?yōu)榈投揪奂w等類型。近年來,越來越多的過渡金屬配合物被報(bào)道具有抑制Aβ聚集的作用。其中,一些釕配合物被報(bào)道具有良好的抑制Aβ聚集的效果,并且有些釕配合物還同時(shí)具有抑制和監(jiān)測(cè)Aβ聚集的雙功能作用。與其它的金屬配合物相比,釕配合物的毒性較低,是一種潛在的Aβ聚集調(diào)節(jié)劑,有望開發(fā)成為新型的AD藥物。因此,深入開展釕配合物與Aβ的相互作用的研究,對(duì)尋找合適的Aβ聚集調(diào)節(jié)劑具有重要意義。
本論文選取含雙羥基的兩種釕配合物Ru[(phen)2(DHOPIP)]2+(p23OH)和Ru[(phen)2(DHMPIP)]2+(p25OH),通過ThT熒光、AFM、TEM和可溶性蛋白含量測(cè)定等方法研究了兩種釕配合物對(duì)Aβ42纖維化的抑制效果。在ThT方法中,硫磺素T(ThT)能夠特異性地識(shí)別、結(jié)合具有β片層的Aβ纖維體,從而使自身熒光顯著增強(qiáng),常用于檢測(cè)Aβ聚集,體系中熒光強(qiáng)度越大,表明Aβ聚集體越多[17,18],反之熒光強(qiáng)度越低,表明Aβ聚集體越少,所以可以通過ThT熒光方法檢測(cè)釕配合物對(duì)Aβ聚集的影響。結(jié)果顯示兩種釕配合物都能有效的抑制Aβ聚集,并且呈現(xiàn)出劑量關(guān)系,釕配合物的濃度越大,對(duì)Aβ42纖維化的抑制效果就越明顯,而且p23OH抑制Aβ42聚集能力明顯高于p25OH 。同時(shí)AFM和TEM結(jié)果直觀表明在不加釕配合物的時(shí)候,Aβ42自身會(huì)快速聚集成纖維聚集體,而在p23OH和 p25OH存在下,極大地減少了Aβ42纖維化??扇苄缘鞍缀繙y(cè)定也說明兩種釕配合物能夠有效降低Aβ42聚集,增加Aβ42的溶解性。Aβ在腦組織中聚集形成沉淀或纖維化,而對(duì)中樞神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性,造成中樞神經(jīng)損傷,細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,p23OH和 p25OH能夠減弱Aβ42纖維化產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。熒光滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,兩種釕配合物使Aβ42熒光淬滅的方式主要為靜態(tài)熒光淬滅。隨著配合物濃度的增加,動(dòng)態(tài)淬滅的效果逐漸增強(qiáng),靜態(tài)淬滅效果減弱。兩種釕配合物與Aβ42結(jié)合的表觀結(jié)合常數(shù)都小于0.08 mol/L,說明兩種釕配合物與Aβ42的相互作用較弱,主要以非共價(jià)作用形成復(fù)合物,如靜電作用、疏水作用和氫鍵作用等。
綜上所述,本論文中合成的p23OH和 p25OH配合物能夠有效的抑制Aβ纖維化,減弱Aβ42纖維化產(chǎn)生的細(xì)胞毒性,說明這兩種釕配合物在治療AD方面可能具有潛在的應(yīng)用前景。