錢(qián)明敏 章 鵬 許婷婷 許慧敏 孫 寒 羅 俠 孫 星

（滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州 239000）

纖維素作為地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物，經(jīng)纖維素酶降解之后可轉(zhuǎn)化為食物、燃料和化學(xué)制品，應(yīng)用十分廣泛，涉及到人類的衣、食、住、行等方方面面，是人類擁有的最具前景的資源之一［1］。纖維素酶是一類能夠水解纖維素的β-D-糖苷鍵生成葡萄糖的多組分酶的總稱。從類別上看，它屬于核苷水解酶類，廣泛存在于微生物和一些植物體中。而由于在纖維素酶生產(chǎn)過(guò)程中，存在纖維底物需求高度復(fù)雜、生產(chǎn)成本較高、纖維素酶活力較低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等問(wèn)題，導(dǎo)致當(dāng)前纖維素酶制造產(chǎn)業(yè)在我國(guó)依然處于研究開(kāi)發(fā)的階段。因此，尋找、開(kāi)發(fā)活力高、針對(duì)性強(qiáng)的產(chǎn)纖維素酶菌株是高效利用纖維素資源的關(guān)鍵［2-3］。

滁菊作為全國(guó)4大白菊之首，素有“金心玉瓣，翠蒂天香”之美譽(yù)。在滁州，每年滁菊收獲后都會(huì)殘留大量的莖稈，莖稈直接還田后由于其高纖維素含量，造成土壤碳氮比失調(diào)、土壤板結(jié)等一系列問(wèn)題。本研究通過(guò)對(duì)滁菊種植地地上中產(chǎn)纖維素酶分解菌進(jìn)行分離與篩選鑒定，旨在篩選出能最大程度地降解滁菊莖稈的高產(chǎn)纖維素酶菌株。

1 材料與方法

1.1 采集樣品在滁菊種植田中間部位對(duì)樣本土壤進(jìn)行“S”型采樣，為了避免實(shí)驗(yàn)的偶然性，共采取5處的土壤樣品。

1.2 制備培養(yǎng)基以纖維素為唯一碳源的固體培養(yǎng)基：在500mL赫奇遜（hutchison）營(yíng)養(yǎng)液中加入濾紙漿5mL，瓊脂粉10.00g。赫奇遜營(yíng)養(yǎng)液：磷酸二氫鉀1.00g，氯化鈉0.10g，硝酸鈉2.50g，硫酸鎂0.30g，三氯化鐵0.01g，氯化鈣0.10g，蒸餾水1000mL，pH7.2左右。濾紙漿：定量撕碎的濾紙和適量水于燒杯中煮沸1h，并用玻璃棒不斷攪拌，制成懸浮物備用。纖維素-剛果紅培養(yǎng)基：百思生物公司購(gòu)買(mǎi)。產(chǎn)酶培養(yǎng)基：滁菊莖稈粉末26.00g，硫酸銨1.89g，硫酸二氫鉀5.31g，硫酸鎂0.30g，氯化鈣0.30g，吐溫1.50mL，硫酸亞鐵0.005g，硫酸鋅0.0014g，硫酸錳0.0016g，氯化鈷0.002g，蒸餾水1000mL。

1.3 初篩產(chǎn)纖維素酶菌種稱取土壤樣品1g，放入含99mL無(wú)菌水的錐形瓶中，振蕩搖勻。然后按10倍濃度梯度分別稀釋成10-3，10-4稀釋液。將已滅菌的以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待其冷卻凝固后，用無(wú)菌移液管吸取0.2mL稀釋液倒入平板上，再用玻璃涂布棒在平板表面輕輕涂抹以至均勻，最后將平板放置于30℃左右的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h。

1.4 復(fù)篩產(chǎn)纖維素酶菌種將初篩分離得到的菌種用接種環(huán)劃線到纖維素-剛果紅培養(yǎng)基上，再將上述平板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d后，觀察是否有透明圈生成。

1.5 分離純化目的菌株將上述4種產(chǎn)生透明圈的菌落用接種環(huán)分離純化，接種劃線至以纖維素為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，再將這些平板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

1.6 制備斜面固體培養(yǎng)基在100mL的赫奇遜（hutchison）中加入濾紙漿1mL，瓊脂粉2.00g，制成培養(yǎng)基，在4個(gè)試管中分別倒入15mL已配好的培養(yǎng)基，傾斜15°待其冷卻凝固后接種上述已純化菌落，放入冰箱中冷藏保存，以便備用。

1.7 制備粗酶液將上述已分離純化的菌株接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于28℃下在振蕩水浴鍋中恒溫培養(yǎng)5d，轉(zhuǎn)速為160r/min。然后，將發(fā)酵液經(jīng)5000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，除去菌體后保留上層清液，即為所得粗酶液。

1.8 測(cè)定酶活力采用分光光度法測(cè)定酶液吸光值。以3，5-二硝基水楊酸（DNS）為顯色劑在550nm處測(cè)得不同濃度葡萄糖的吸光值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以分光光度計(jì)測(cè)得的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。0.5mL各酶液分別加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液于50℃水浴鍋中水浴糖化30min，取出后，沸水浴得糖化液，冷卻，再分別加入2mLDNS顯色劑，沸水浴中煮沸10min，待其冷卻，加水定容稀釋5倍，振蕩混勻后，在550nm處測(cè)得各酶液的吸光值。纖維素酶活力單位=（N×OD550值對(duì)應(yīng)的葡萄糖量）/（30×1）。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各菌種在550nm處OD值所對(duì)應(yīng)的葡萄糖量，代入公式即得每克各菌種中纖維素酶活力單位。

1.9 鑒定目的菌株將2號(hào)菌株接種至稍厚的平板中，實(shí)用載玻片進(jìn)行插片培養(yǎng)數(shù)日后，拿去做鏡檢觀察，并將接種有2號(hào)菌株的斜面固體培養(yǎng)基寄往通用生物公司測(cè)定其DNA序列。根據(jù)所得到測(cè)序目的序列到NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，并構(gòu)建發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌種的初篩從滁菊產(chǎn)地的土壤樣品中，以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基篩選微生物。篩選到5種可以在以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

2.2 產(chǎn)纖維素酶菌種的復(fù)篩和分離純化將初篩分離得到的菌種用接種環(huán)劃線到纖維素-剛果紅培養(yǎng)基上，再將上述平板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d后，觀察有透明圈生成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4種菌落周圍生成了清晰可見(jiàn)的透明圈，給其編號(hào)為1，2.3，4。

2.3 產(chǎn)纖維素酶菌種的酶活力不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液在550nm處的吸光值并得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液在OD550處的吸光值

利用分光光度計(jì)測(cè)出樣品在550nm處的吸光值，求得每克各菌種中纖維素酶活力單位（表1）。比較表1中纖維素酶活力大小，得出2號(hào)為篩選的目的菌株。

表1 各菌種的酶液在550nm處的吸光值

2.4 產(chǎn)纖維素酶菌株鏡檢鑒定對(duì)2號(hào)菌株進(jìn)行顯微鏡觀察：目的菌株菌落黃綠色，外觀干燥不透明，質(zhì)地疏松，呈絲絨狀，在顯微鏡下觀察清晰可見(jiàn)頂囊球形或燒瓶形，分生孢子呈近球形或橢圓形（圖2），初步鑒定為霉菌［11］。

圖2 目的菌株在高倍顯微鏡下的鏡檢結(jié)果（放大倍數(shù)：上：10×10；下：10×40）

2.5 產(chǎn)纖維素酶菌株分子鑒定1%的瓊脂糖鑒定（如圖3～4）并使用Axygen凝膠回收試劑盒回收所需PCR產(chǎn)物片段。PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，跑3730XL測(cè)序儀，根據(jù)所得到測(cè)序目的序列到NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)（圖5），并構(gòu)建發(fā)育樹(shù)（圖6）。經(jīng)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)目的菌株與紅綬曲霉親緣關(guān)系最為接近，故將其命名為Aspergillus nomius.MFCJ。

菌株MFCJ的序列如下：

TTCCTCCGCCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGG GTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTGGAAAGAATG GTTGTTTTGCGTTCGGCAAGCGCCGGCCGGGCCTA CAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGAT CGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTAGGGCCCGTCCCC CCCCGGAGAGGGGGACGACGACCCAACACACAAG CCGTGCTTGATGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGG CATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCG TTCAAAGACTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCAC ACTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATG CCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACT GATTGCGATACAATCAACTCAGACTTCACTAGATCGTT CAGAGTTCGTGGTGTCTCCGGCGGGCGCGGGCCCG GGGGCGGATGCCCCCCGGCGGCCTTGCGGCGGGCC CGCCGAAGCAACTAAGGTACAGTAAACACGGGTGGGA GGTTGGGCTCGCTAGGAACCCTACACTCGGTAATG ATCCTTCCGCAGGTTCACCCTACGGAAGG

圖3 瓊脂糖鑒定結(jié)果

圖4 樣品膠

Blast比對(duì)結(jié)果：

圖5 Blast比對(duì)結(jié)果

構(gòu)建發(fā)育樹(shù)如下：

圖6 目的菌株發(fā)育樹(shù)

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)滁菊種植基地土壤中產(chǎn)纖維素酶分解菌進(jìn)行分離篩選與鑒定，并對(duì)分離出的菌株所產(chǎn)纖維素酶進(jìn)行活力檢測(cè)，結(jié)果表明，所得的Aspergillus nomius.MFCJ菌株能很好地降解滁菊莖稈，使滁菊莖稈得到充分有效的利用。