尹冬梅

【摘? 要】目的：通過PCR和測序法檢測rpoB基因利福平耐藥區(qū)域（RRDR）是否存在突變并測定其突變位點(diǎn)。方法：收集臨床分離結(jié)核桿菌DNA檢測陽性標(biāo)本，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增其rpoB基因，擴(kuò)增產(chǎn)物測序，并將測序結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中對比。結(jié)果：30例結(jié)核DNA陽性標(biāo)本中，有25例rpoB 基因PCR 擴(kuò)增陽性者， 有18例測序成功，與PUBMED BLAST中標(biāo)準(zhǔn)菌株rpoB基因?qū)Ρ?，存在突變的菌株?0例，沒有突變的菌株有8例，突變率為55.56%，突變核心區(qū)域突變率為90.0%。結(jié)論：rpoB 基因PCR 檢測在可輔助診斷結(jié)核病的同時， 對其產(chǎn)物進(jìn)行測序可直接判別對利福平耐藥與否，能給臨床提供快速用藥指導(dǎo)。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌;PCR;rpoB基因;利福平耐藥

【中圖分類號】R454????? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A????? 【文章編號】1672-3783（2019）03-0047-02

結(jié)核病是艾滋病病毒感染者和患者常見的機(jī)會性感染和主要死亡原因^[1]近年來，我國的結(jié)核病發(fā)病率和耐藥率均有上升趨勢，尤其是耐多藥結(jié)核病和非結(jié)核分枝桿菌病及艾滋病并發(fā)的結(jié)核病的疫情十分嚴(yán)峻，并嚴(yán)重?fù)p害著人們的健康^[2]。對疑似結(jié)核病患者，首先需快速確定結(jié)核分枝桿菌感染，在此基礎(chǔ)上，再對其耐藥性進(jìn)行快速檢測。因此，只有建立快速、準(zhǔn)確的耐藥性檢測方法，對異煙肼、利福平耐藥結(jié)核病的早期診斷和指導(dǎo)臨床用藥才具有實(shí)用性。

1 實(shí)驗(yàn)對象

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)菌株

結(jié)核分枝桿菌DNA陽性結(jié)果的標(biāo)本收集來自于2017年1月至2017年5月四川省人民醫(yī)院住院或門診患者分離的無重復(fù)的標(biāo)本，其中支氣管肺泡灌洗液15例，痰液12例，清潔中段尿2例，血液1例。

1.2主要材料及試劑

2×Taq Mixture、LA Taq 高保真DNA聚合酶、dNTPs、5×LA Taq Buffer Ⅱ（Mg²⁺plus）（TaKaRa）;100bp DNA Ladder （ 北京天根）;GoldviewⅠ型核酸染色劑：瓊脂糖（Biowest）;各種引物由成都擎科梓熙生物公司合成。

1.3主要溶劑配制

（1）5×TBE緩沖溶液（1000ml ）：

硼酸27.5g，Na2EDTA.2H2O 3.72g加入800ml去離子水，玻璃棒攪拌溶解，定溶1000ml，常溫保存。

（2）瓊脂糖凝膠

稱量0.5克瓊脂粉至燒瓶中，加入50ml0.5×TBE緩沖液。加熱2分鐘至沸騰，冷卻至60-70℃，加入5 ?l GoldviewⅠ型核酸染色劑，充分混勻。將瓊脂液注入凝膠池，放置“梳子”，待30min后，其冷卻凝固成型，拔掉梳子備用。

1.4主要儀器

超凈工作臺（上海Boxun）;生物安全柜;PCR擴(kuò)增儀PTC-200（美國Bio-Rad公司）、微量移液器、電子天平（上海民橋精密儀器廠）;電泳儀（Sanvant）;凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）;普通冰箱（中國海爾）、低溫冰箱（SANYO）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1標(biāo)本收集及處理

留取標(biāo)本3～5ml 于有蓋滅菌容器中。加2倍體積1N NaOH 溶液堿化痰液， 吸取500μl 標(biāo)本混懸液移入0.5ml離心管內(nèi)， 1500rpm離心10min。吸棄上清液，加裂解液A 50μl， 裂解液B 2μl混勻， 置55℃保溫1h 后改95℃保溫10min， 10000rpm離心30s。

2.2熒光定量PCR 檢測確認(rèn)結(jié)核分枝桿菌

反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5.0?l，MgCl2（25 mmol/l）7.0 ?l，dNTPs（2.5 mmol/l）3.0?l，dUTP（10 mmol/l）2.0?l，MTB 上下游引物（20μmol/l）各1.5?l，探針（10μmol/l）1.0?l，UNG 酶（1U/?l）0.5?l，Taq 酶（5U/?l）0. 5?l，模板25?l，補(bǔ)水至50?l。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，共40 個循環(huán)。以結(jié)核分枝桿菌H37Ra 為參考菌株，PCR 擴(kuò)增IS6110基因，將稀釋至10⁷copies/ml 的DNA 作為強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋至10³copies /ml 的DNA 作為弱陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌rpoB基因片段

根據(jù)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的rpoB基因標(biāo)準(zhǔn)序列信息（從NCBI獲得），利用引物rpoB（5CAGACGTTGATCAACATCCG3）和rpo4（5TACGG CGTTTCGATGAAC3），擴(kuò)增含有81bp利福平耐藥決定區(qū)（RRDR）的305bp片段。PCR在MJ微型熱循環(huán)儀中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)所用反應(yīng)體系（50?l）： 2×Taq Master-Mix 25?l，前引物和后引物（F、R）各0.5?l，模板DNA 2?l，DH2O 22?l。具體反應(yīng)條件為92℃預(yù)變性3min，92℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，如此30個循環(huán)，最后72℃延伸5mim。獲得的基因產(chǎn)物4℃冰箱保存?zhèn)溆?。產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳后Bio-Rad凝膠成像儀檢測，根據(jù)條帶結(jié)果確定有無目的基因。

2.3擴(kuò)增后基因產(chǎn)物電泳凝膠成像并分裝及測序

擴(kuò)增后的基因產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。方法：將新倒好的凝膠放入電泳槽中，加樣孔一側(cè)放在負(fù)極端（共8孔），向第一孔加入5?l DNA Marker，其余加樣孔中分別加入DNA擴(kuò)增產(chǎn)物5?l。通電，120V，100mA，電泳30分鐘。電泳完成后將膠板放入凝膠成像儀（Bio-Rad）中，觀察電泳條帶的清晰程度以及位置。確認(rèn)基因的存在。對電泳成功剩余的擴(kuò)增產(chǎn)物裝進(jìn)EP管內(nèi)，做好基因以及標(biāo)本號的標(biāo)記并用封口膠封住。放入冰箱保存，待下一步的序列分析。

2.4 PCR產(chǎn)物凝膠回收

PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠回收試劑盒，根據(jù)說明書提供的方法進(jìn)行產(chǎn)物回收。

2.5對擴(kuò)增基因產(chǎn)物進(jìn)行序列比對及分析

將純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測序，將測序結(jié)果用軟件與PUBMED BLAST的rpoB基因標(biāo)準(zhǔn)序列比較分析，確定突變位點(diǎn)和類型。

3 結(jié)果

3.1 pcr擴(kuò)增結(jié)果

如圖（1），預(yù)實(shí)驗(yàn)選取1000bpDNA ladder做為makker，第二孔為陰性對照孔，后面依次為隨機(jī)選擇的標(biāo)本?？梢钥闯鰉akker和部分標(biāo)本是能擴(kuò)增出條帶的，實(shí)驗(yàn)條件是可行的，可以繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

30例結(jié)核DNA陽性標(biāo)本中，有25例rpoB 基因PCR 擴(kuò)增陽性者， 將這25例pcr條帶進(jìn)行提純。提純后的標(biāo)本送至成都擎科梓熙生物公司進(jìn)行測序。

Lane 1： 1000bp DNA Ladder???? Lane 2： 結(jié)核DNA陰性的標(biāo)本

Lane 3：標(biāo)本3-2????????? Lane 4：標(biāo)本3-1

Lane 5：標(biāo)本2-1???????? Lane 6：標(biāo)本2-2

Lane 7：標(biāo)本2-3?? ????? Lane 8：標(biāo)本2-4

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3.2 測序結(jié)果

實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物在預(yù)實(shí)驗(yàn)成功后進(jìn)行封存，交由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。序列結(jié)果如期返回，其結(jié)果顯示有18例擴(kuò)增產(chǎn)物都可以得到基因有效序列，截取每個基因在長度0-350bp區(qū)間的序列圖，分析結(jié)果如下。

3.3 比對結(jié)果

對包含RRDR 耐藥決定區(qū)的305 bp rpoB 基因擴(kuò)增片段進(jìn)行DNA 測序。如表1

3 討論

利福平（RFP），是常用的一線抗結(jié)核藥物之一。利福平通過和結(jié)核菌中DNA轉(zhuǎn)錄依賴的RNA聚合酶的結(jié)合來抑制轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致細(xì)胞死亡^[3]。耐藥結(jié)核的出現(xiàn)常常導(dǎo)致結(jié)核患者治療的失敗與死亡，快速檢測結(jié)核藥敏，對結(jié)核患者臨床用藥有十分重要的指導(dǎo)意義。本文對標(biāo)本進(jìn)行rpoB 基因PCR 擴(kuò)增和測序共需時間3 天。耗時遠(yuǎn)較常規(guī)方法為短。為結(jié)核病患者在第一時間合理治療贏得了寶貴時間。將分子學(xué)方法與快速藥敏實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，為臨床提供快速的用藥指導(dǎo)具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

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[3]????? 李群， 王曉萌. WHO 浙江省結(jié)核病耐藥監(jiān)測研究報告[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志， 2000， 23（12）： 718-721.