李 楠， 郭海濱， 李亞娟， 勞媚媚

(華南農(nóng)業(yè)大學 公共基礎(chǔ)課實驗教學中心，廣州 510642)

0 引 言

遺傳學是探究生物遺傳和變異規(guī)律的理論科學，是生命科學領(lǐng)域的基礎(chǔ)學科，研究內(nèi)容豐富，小到基因結(jié)構(gòu)、功能及表達，大到生物群落的遺傳特征[1]。遺傳學理論與實踐關(guān)系密切，實驗不僅是遺傳學的重要基礎(chǔ)，更是培養(yǎng)創(chuàng)新能力的重要環(huán)節(jié)[2]。劉向東等[3]結(jié)合國外“混合式學習”方法，提出了適合華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)科類專業(yè)的“創(chuàng)新型混合教學模式”遺傳學教學改革法。2009年，根據(jù)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的需要，構(gòu)建了四模塊、三層次、二整合和一方案的實驗內(nèi)容和教學體系，探索出一套適合現(xiàn)代農(nóng)學專業(yè)創(chuàng)新性實驗教學體系[4-5]。將依附理論課的實驗剝離，實現(xiàn)實驗教學的獨立設(shè)課，2014年農(nóng)學院實踐教學大綱中，遺傳學實驗從8學時和16學時的驗證性實驗內(nèi)容拓展到32學時、48學時和64學時綜合性、研究性實驗內(nèi)容。突出了綜合性實驗對培養(yǎng)創(chuàng)新人才的重要性，推動了綜合性實驗的設(shè)計與應(yīng)用。

綜合性實驗的設(shè)計思路主要來源于3方面：① 探索驗證性實驗間的共通性，提升為綜合性實驗，如經(jīng)典遺傳學綜合性實驗。② 將科研項目成果(包括前沿的研究內(nèi)容、新穎的材料與方法、科學的研究結(jié)果等)與實驗教學結(jié)合，提煉出綜合性實驗，如分子遺傳學綜合性實驗(包括DNA提取、PCR、電泳等)、基因工程實驗。③ 將大學生創(chuàng)新性實驗項目與實驗教學結(jié)合，利用其研究周期短、研究內(nèi)容不深、研究方法創(chuàng)新等優(yōu)勢，設(shè)計綜合性實驗項目。2012年至今，依托公共基礎(chǔ)課實驗教學中心立項的國家、省、校級創(chuàng)新訓練項目有83項，其中結(jié)合老師科研項目的有51項，結(jié)合實踐教學的有21項，該實驗的設(shè)計思路則來源于此。通過實驗教學證明，綜合性實驗在培養(yǎng)學生的綜合能力、創(chuàng)新能力及研究能力上發(fā)揮了重要的作用[6]。

1 秋水仙素對洋蔥根尖細胞有絲分裂影響實驗設(shè)計

1.1 實驗?zāi)康?/p>

(1) 掌握生物顯微鏡操作技能，顯微圖像拍攝與統(tǒng)計分析系統(tǒng)使用技巧，有絲分裂制片技術(shù)。

(2) 學習人工誘導植物組織染色體變異方法和方差分析法。

(3) 掌握有絲分裂動態(tài)變化過程及染色體結(jié)構(gòu)變異、數(shù)目變異等特征。

(4) 了解秋水仙素對植物遺傳與變異的影響，激發(fā)學生深入思考其他誘變劑(如重金屬、污水、洗滌劑等)對植物遺傳與變異的影響，開展下一步研究性實驗設(shè)計。

1.2 實驗原理

有絲分裂是真核生物細胞分裂的基本形式，各種生長旺盛的植物組織，如根尖、莖尖、愈傷組織等常進行著活躍的體細胞有絲分裂。有絲分裂可劃分為前期、中期、后期和末期。有絲分裂進程中，在一些因素的影響下(如物理因素、化學藥劑)，會干擾分裂進程，出現(xiàn)缺失、重復(fù)、倒位、易位及染色體數(shù)目增減等變異類型。并在以后的細胞分裂過程中產(chǎn)生一些異常的細胞學現(xiàn)象和特殊的遺傳學效應(yīng)。如：缺失環(huán)、重復(fù)環(huán)、后期染色體橋、斷片、微核及加倍等[7]。

秋水仙素是一種常用誘變劑，是從百合科秋水仙屬的秋水仙(ColchicumautumnaleL.)器官和種子內(nèi)提煉出來的一種植物堿。能阻止分裂細胞形成紡錘絲，使復(fù)制后的染色單體無法移向兩極，細胞不分裂，進而實現(xiàn)染色體加倍[8-9]。自1937年美國學者布萊克斯利等用秋水仙堿加倍成功曼陀羅的染色體后，秋水仙堿就被廣泛應(yīng)用于細胞學、遺傳學的研究和植物育種中[10]。研究表明秋水仙素對實驗材料適當處理后，會影響細胞有絲分裂指數(shù)并誘發(fā)染色體結(jié)構(gòu)變異，出現(xiàn)斷片、微核、雙核、后期橋、加倍等變異特征[11-12]。

1.3 實驗材料、試劑與儀器

實驗材料：洋蔥(2n=16)，購自農(nóng)貿(mào)市場。

實驗試劑：秋水仙素,用蒸餾水配制成 0.1%秋水仙素溶液;卡諾固定液,無水酒精∶醋酸=3∶1;改良苯酚品紅,1 mL苯酚品紅+9 mL 45%冰醋酸+0.1 g山梨醇;鹽酸1 mol/L。

實驗儀器：恒溫生化培養(yǎng)箱(寧波萊?？萍加邢薰?，PQX-330A-12HM)、顯微鏡(奧林帕斯，CX31)、水浴鍋。

1.4 實驗方法

1.4.1 洋蔥發(fā)根與誘導方法

洋蔥發(fā)根：取新鮮洋蔥鱗莖，剝?nèi)ネ鈱痈煽蓣[片，切去殘余老根，將鱗莖盤浸泡于蒸餾水中，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，當不定根長出2 cm時備用。

誘導方法：以蒸餾水(CK)為對照，將不定根置于蒸餾水和0.1%濃度秋水仙素溶液中浸泡22 h后，于10 am取出，放入固定液中固定24 h，再經(jīng)95%、80%乙醇中各停留30 min后，于70%的乙醇中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 有絲分裂制片技術(shù)

解離：取固定后的洋蔥根尖置于1 mol/L HCl溶液中60 ℃水浴13 min，再經(jīng)蒸餾水反復(fù)浸泡3次，每次停留5 min。

制片：放1～2個根尖在載片上，用鑷子將根尖敲至漿狀。再用卡寶品紅染色液染色3～5 min，蓋片，用橡皮在蓋玻片上輕輕敲勻使細胞分散均勻，最后置于光學顯微鏡下觀察。

1.4.3 實驗要求與數(shù)據(jù)分析

在兩組對比實驗中，要求每人每組實驗處理至少3個洋蔥，根尖數(shù)在60條左右。

(1) 統(tǒng)計對照組與處理組的洋蔥根尖膨大率。

(2) 觀察有絲分裂動態(tài)變化過程及染色體結(jié)構(gòu)變異、數(shù)目變異等細胞特征，并作圖。

(3) 每組實驗材料至少制作10張觀察片，利用顯微圖像拍攝與統(tǒng)計分析系統(tǒng)，記錄每張觀察片1 000細胞中處于有絲分裂各時期、后期橋、微核及加倍的細胞數(shù)目，利用方差分析法對比兩組實驗的有絲分裂指數(shù)和細胞染色體變異率，得出結(jié)論。

(4) 討論秋水仙素對洋蔥根尖細胞有絲分裂影響。

變異細胞鑒別標準。微核鑒別①存在時相：微核在完整的分裂期細胞中，形態(tài)為圓形或橢圓；②體積：直徑小于主核的20%；③與主核的關(guān)系：與主核完全脫離；④染色：染色與主核完全一致。橋鑒別①存在時相：橋必須在完整的后期細胞中，形態(tài)為細胞兩端著絲粒共同牽引著一條染色體；②染色：染色與其他染色體完全一致。

數(shù)據(jù)分析：有絲分裂指數(shù)=分裂細胞數(shù)/觀察細胞總數(shù)；變異率=該類畸變細胞數(shù)/觀察細胞總數(shù)。

1.5 實驗結(jié)果與討論

(1) 洋蔥根尖膨大率統(tǒng)計。觀察兩組實驗中洋蔥根尖的外觀形態(tài)變化，記錄根尖膨大率，初步了解秋水仙素對植物外觀形態(tài)的影響。實驗結(jié)果表明，經(jīng)秋水仙素溶液處理后洋蔥根尖膨大率較高，可達85%～95%。

主要儀器：Qubit? 2.0熒光計(Invitrogen Q32866)，凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP)，PCR 儀(Eppendorf，T100TM Thermal Cyeler)，電泳儀電源（北京市六一儀器廠，DYY-6C型），臺式離心機（Thermo Fisher，Pico-21）。

(2) 觀察有絲分裂染色體動態(tài)變化過程及染色體結(jié)構(gòu)變異、數(shù)目變異等細胞特征，并作圖如圖1、2所示。

1.間期

2.前期

3.中期

4.后期

5.末期

1.間期微核

2.后期染色體橋

3.中期加倍

(3) 利用方差分析法比較兩組實驗的有絲分裂指數(shù)和細胞染色體變異率，得出如圖3所示結(jié)論。

圖3 秋水仙素溶液對洋蔥根尖細胞分裂指數(shù)和變異率的影響

由圖3可知，秋水仙素有促進細胞有絲分裂的能力。以蒸餾水(CK)為對照，實驗表明洋蔥根尖細胞經(jīng)秋水仙素溶液處理后處于前期、中期及分裂期的細胞指數(shù)明顯增加，均達到顯著或極顯著差異。尤其處于中期的細胞，與對照相比，達極顯著差異，表明秋水仙素具有促進細胞染色體停滯在中期的能力，這一實驗結(jié)果與前人研究一致[8-9]。

秋水仙素對洋蔥根尖細胞染色體有畸變效應(yīng)。經(jīng)秋水仙素溶液處理后，有絲分裂細胞中后期橋的變異率為0.31%，微核的變異率為0.43%，加倍的變異率為0.86%，與對照均達到極顯著差異。表明秋水仙素有誘導染色體產(chǎn)生后期橋、微核、加倍等變異現(xiàn)象。

通過實驗觀察與數(shù)據(jù)分析，因秋水仙素有促進細胞有絲分裂能力和誘導染色體產(chǎn)生畸變效應(yīng)，進而致使洋蔥根尖從外觀形態(tài)上表現(xiàn)出膨大特征。說明部分化學試劑對植物遺傳有影響，進而影響植物外觀形態(tài)、生長發(fā)育，甚至威脅生命健康。

2 綜合性實驗的實踐體會

2.1 驗證性實驗與綜合性實驗優(yōu)勢互補

驗證性實驗在實踐教學中已運用多年，在印證理論知識上有著不可替代性作用，是學生實驗的入門基礎(chǔ)，可規(guī)范和培養(yǎng)學生的基本實驗技能[13]。綜合性實驗則是在驗證性實驗基礎(chǔ)上的提升，旨在提高學生綜合應(yīng)用知識的能力、創(chuàng)新能力及研究能力。該細胞遺傳學綜合性實驗利用了對比的方法，融合了驗證性實驗和綜合性實驗內(nèi)容，實現(xiàn)了兩者的優(yōu)勢互補。

2.2 傳授式教學與問題引導式教學相結(jié)合

在結(jié)構(gòu)變異驗證性實驗教學中，因?qū)嶒灢牧?、誘導劑、誘導方式、變異率、學生操作、課堂時間等綜合因素的影響，致課堂中只有部分學生可觀察到結(jié)構(gòu)變異現(xiàn)象，且觀察的變異類型少。針對該問題，老師與學生進行深入探討，激發(fā)學生思考。部分學生會利用大學生創(chuàng)新訓練項目、畢業(yè)論文等形式，在老師指導下開展研究，如綠茶對植物染色體變異的抑制作用研究、秋水仙素誘導洋蔥根尖染色體結(jié)構(gòu)變異研究、植物根尖微核及染色體畸變技術(shù)研究等。

老師將學生的研究成果與實驗教學結(jié)合，總結(jié)提煉出該細胞遺傳學綜合性實驗。教學過程中采用了傳授式教學法與問題引導式教學法相結(jié)合[14]，提出秋水仙素對洋蔥根尖細胞有絲分裂有怎樣影響的問題，并結(jié)合理論教學講授有絲分裂驗證性實驗原理及方法，提供相關(guān)參考文獻資料。學生結(jié)合問題和學習資料，設(shè)計實驗，開展綜合性實驗研究。并在綜合性實驗基礎(chǔ)上，老師進一步引導式提問，如是否有感興趣的實驗材料？是否想了解秋水仙素或是其他誘變劑對該材料的影響？是否想了解環(huán)境污染與植物遺傳的關(guān)系？等，引導學生發(fā)散思維，進行創(chuàng)新型實驗設(shè)計。

2.3 開展創(chuàng)新研究性實驗，自我提升綜合能力

在整個實驗過程中學生的主觀能動性非常重要，一方面需要學習合理利用經(jīng)費和時間，購置實驗用品，安排研究進程，保證實驗的順利完成；另一方面需要發(fā)揮團隊合力，拓展遺傳學及相關(guān)學科的理論和實踐知識，并將其運用于實驗研究中解決困難，最終實現(xiàn)自我創(chuàng)新能力、科研能力、綜合能力的提升。

2.4 改進實驗材料，提升觀察效果

以前結(jié)構(gòu)變異誘導與鑒定實驗一直以伽瑪射線(吸收劑量為31.0～40.0 Gy)輻照大蔥小孢子母細胞產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變異作為實驗材料，但該材料的教學應(yīng)用效果并不理想。微核的誘導率為0.21%，后期橋的誘導率為0.11%。從每年上課反饋的數(shù)據(jù)分析，使用大蔥幼花材料，每班僅20%左右的同學觀察到“微核”現(xiàn)象，觀察到“后期橋”現(xiàn)象的少于10%。

自從以秋水仙素誘導洋蔥根尖細胞產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變異作為實驗材料后，微核的誘導率達0.43%，后期橋的誘導率達0.31%。平均每班通過實驗操作觀察到細胞分裂相的學生達90%以上，觀察到微核的達84%，觀察到“后期橋”現(xiàn)象的達55%，觀察到染色體加倍等異?，F(xiàn)象的達59%(見表1、2)。相較大蔥幼花實驗材料，有更多學生觀察到染色體結(jié)構(gòu)變異現(xiàn)象，在教學應(yīng)用中取得了很好的觀察效果。

表1 遺傳學實驗室2016年本科遺傳學實驗教學情況匯總表

表2 學生觀察到各種染色體結(jié)構(gòu)變異現(xiàn)象的人數(shù)統(tǒng)計

另外，秋水仙素誘導洋蔥根尖細胞產(chǎn)生的變異類型多，如不均等分裂、多核、斷片、染色體數(shù)目上的各種變異等[15]。這些現(xiàn)象會引起學生探究的興趣，觸發(fā)學生與老師交流，實現(xiàn)老師與學生共同學習和研究的目的。

3 結(jié) 語

該細胞遺傳學系列實驗采用了“驗證性-綜合設(shè)計性-創(chuàng)新研究性實驗”的多層次、研究性實驗教學方式，對提高學生的綜合能力、創(chuàng)新能力及研究能力有顯著效果。驗證性實驗、綜合性實驗、研究性實驗屬于科學實驗的方法，是層層遞進的關(guān)系，在培養(yǎng)學生綜合創(chuàng)新能力上發(fā)揮著不可替代性作用。驗證性實驗是學生進入科學研究領(lǐng)域前的基石，旨在讓學生掌握實驗的基本技能，老師對學生的教學方式，主要以面對面的傳授式教學法。在適當時機以問題引導的教學方式，激發(fā)學生思考，順利進入綜合性實驗研究。綜合性實驗是學生進入科研研究領(lǐng)域前的傳送帶，旨在激發(fā)學生研究的興趣，學習研究的基本方法。老師對學生的教學方式，需根據(jù)綜合性實驗的特點，采用組合式教學法，如傳授式、問題引導式、翻轉(zhuǎn)課堂式、專題式、自主研究式、分組合作式、討論分析式等[16-17]。研究性實驗是學生進入科學研究領(lǐng)域的縮影，旨在讓學生了解科學研究的過程、問題及方法，進而培養(yǎng)學生獨立研究、團隊合作、創(chuàng)新思維及解決問題的能力[18]。老師對學生的教學方式，是以學生為主體，老師作為學習團隊中的一員，扮演建議者、引導者、鼓勵者的角色。實驗教學改革中，一直摸索著如何在有限的教學時空里，融合這三者的優(yōu)勢，配以行之有效的教學方法，實現(xiàn)創(chuàng)新型、研究型人才的培養(yǎng)。