趙玉紅, 張 偉, 戴若辰, 馬銘陽, 魏奇瀾,蔣沛恩, 孫雨萱, 李 欣, 趙立青

(南開大學(xué) 生物國家級實驗教學(xué)示范中心，天津 300071)

0 引 言

2009年，我校入選教育部第一批“基礎(chǔ)學(xué)科拔尖學(xué)生培養(yǎng)試驗計劃”，成立伯苓班。作為生物學(xué)科拔尖人才培養(yǎng)試點班的生物伯苓班，每年經(jīng)嚴(yán)格選拔，招生約25人。生物學(xué)是實驗性很強的學(xué)科，因此學(xué)生科研能力的訓(xùn)練是拔尖學(xué)生培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)[1]。

生物化學(xué)實驗作為生物學(xué)實驗類專業(yè)課程的先導(dǎo)課，是學(xué)生從事其他生命科學(xué)研究的重要基礎(chǔ)[2-3]。為在生物化學(xué)實驗教學(xué)中培養(yǎng)伯苓班學(xué)生的科研能力，進一步激發(fā)他們的創(chuàng)新潛能，在小班授課、單人操作的基礎(chǔ)上，通過教學(xué)-科研相結(jié)合的方式，由科研實驗室提供部分具有探究性質(zhì)的課題內(nèi)容，作為綜合性實驗項目，面向伯苓班同學(xué)開放選修。

蛋白質(zhì)是一種重要的生物大分子，解析其三維結(jié)構(gòu)有利于闡述其功能。為了研究某蛋白的三維結(jié)構(gòu)，某科研實驗室將目的蛋白基因進行外源高效表達(dá)，經(jīng)純化獲得高濃度、高純度的目的蛋白，然后篩選合適的目的蛋白晶體，對其進行結(jié)構(gòu)解析。但在具體實驗過程中，發(fā)現(xiàn)蛋白晶體質(zhì)量不高。高純度、高濃度的蛋白樣品是獲得高質(zhì)量蛋白晶體的重要前提，考慮到在使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組融合蛋白時，不同的誘導(dǎo)條件對于蛋白的表達(dá)影響很大，優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件十分必要[4]，因此在生物化學(xué)實驗教學(xué)中，設(shè)計“目的蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件的確定及其純化”綜合性實驗項目，對伯苓班學(xué)生進行科研訓(xùn)練，旨在提高學(xué)生科研能力，取得了很好的教學(xué)效果。

1 實驗儀器

AKTA prime plus蛋白純化系統(tǒng)、Amicon濃縮桶、nanodrop 2000超微量紫外分光光度計、超低溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、凝膠成像儀等。

2 實驗材料與試劑

實驗材料：大腸桿菌BL21(DE3)(含某重組蛋白，由科研實驗室提供)。

試劑：Tris，咪唑，NaCl，SDS，甘氨酸，TEMED，AP，考馬斯亮藍(lán)R250，低分子量蛋白Marker，冰乙酸，IPTG，氨芐青霉素等。

預(yù)裝柱：鎳柱(HisTrapTMHP)，凝膠過濾層析柱(HiPrepTM16/60 SephacrylTMS-200 HR)，離子交換柱(HiTrapTMDEAE FF)。

3 實驗方法

3.1 目的蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件的確定

(1) 菌種的培養(yǎng)。將含目的蛋白的大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)活化，以1%的接菌量接種于50 mL LB(含100 μg/mL Amp)培養(yǎng)基中，繼續(xù)擴大培養(yǎng)，作為測定目的蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件的實驗用菌種。

(2) 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。將上述實驗用菌種，以1%的接菌量，分別接種于9瓶100 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃ ，200 r/min，培養(yǎng)至OD值在0.6～0.8之間。分別添加IPTG，至終濃度分別為100、300、500 μmol/L。分別以16、28、37 ℃振蕩培養(yǎng)，于不同時間取樣500 μL，12 000 r/min，離心1 min，棄上清，-20 ℃凍存。其中16 ℃和28 ℃培養(yǎng)的取樣時間為：8、10、12、13.5、14、20、22 h；37 ℃培養(yǎng)的取樣時間為：3、4、5、6、7 h。誘導(dǎo)前設(shè)不加IPTG的陰性對照。

(3) SDS-PAGE電泳檢測。將菌體沉淀用200 μL buffer(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5%甘油，pH 8.0)充分懸浮后，加入等體積的2×蛋白loading，混勻，煮沸5 min。12 000 r/min，離心5 min，取樣15 μL，以5%濃縮膠和12%分離膠進行SDS-PAGE電泳檢測，確定目的蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。

3.2 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及其純化

3.2.1 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

按3.1(1)對菌種進行活化、擴大培養(yǎng)，以1%接菌量接種到1 L的LB培養(yǎng)基中，以最佳誘導(dǎo)條件對目的蛋白進行誘導(dǎo)表達(dá)。4 ℃，8 000 r/min，離心10 min，收集菌體，-20 ℃凍存。

3.2.2 菌體超聲破碎

用40 mL Ni柱結(jié)合緩沖液buffer A(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5%甘油，pH8.0)充分懸浮菌體沉淀后，菌懸液冰上預(yù)冷，超聲破碎。程序：功率180 W，超聲5 s，間歇6 s，直至菌液清亮。超聲破碎后，4 ℃，13 000 r/min，離心40 min，收集上清，作為蛋白樣品粗提液。

3.2.3 目的蛋白純化

(1) Ni親和層析。用Ni親和層析柱對蛋白樣品粗提液進行初步純化。程序：① buffer A平衡His TrapTMHP柱至基線平穩(wěn)；② B泵上樣，buffer A沖洗Ni柱至UV值不再變化；③ 用洗脫緩沖液buffer B(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，5%甘油，1 mol/L咪唑，pH 8.0)和buffer A形成咪唑梯度(180 mL，B：0%～30%)，洗脫目的蛋白。2 mL/管收集洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測。收集目的蛋白液，濃縮桶濃縮至約1 mL。

(2) 離子交換層析。將濃縮的樣品以1∶100的比例用buffer A(50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0)進行稀釋，進一步經(jīng)陰離子交換柱進行純化。程序：① buffer A平衡HiTrapTMDEAE FF柱至基線平穩(wěn)；② B泵上樣，buffer A沖洗直至UV值不再變化；③ 用洗脫緩沖液buffer B(50 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl， pH 8.0)和buffer A形成鹽離子梯度(60 mL，B：0～100%)，洗脫目的蛋白。1 mL/管收集洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測。收集目的蛋白液，濃縮桶濃縮至5 mL以下。

(3) 凝膠過濾層析。濃縮后的樣品進一步經(jīng)凝膠過濾層析純化。流動相：buffer A(50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0)、buffer B(50 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L NaCl，pH 8.0)。程序：① 以15%buffer B平衡HiPrepTM16/60 SephacrylTMS-200 HR一個柱體積；② 15%buffer B洗脫。1.5 mL/管收集洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測。收集目的蛋白液。

3.2.4 蛋白濃度檢測

將純化好的目的蛋白液濃縮至1～2 mL，用nano drop 2000超微量分光光度計檢測蛋白濃度，分裝，-80 ℃凍存。

4 結(jié)果與分析

4.1 蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件的篩選

分別對IPTG不同誘導(dǎo)濃度、不同誘導(dǎo)溫度、不同誘導(dǎo)時間培養(yǎng)的菌種取樣，進行SDS-PAGE電泳檢測(見圖1)。實驗結(jié)果表明，在加入IPTG作為誘導(dǎo)劑時，蛋白Marker 43kDa下方產(chǎn)生1條特異性蛋白條帶，與目的蛋白大小(41 kDa)相一致。由于不同的膠染色、脫色程度不同，難以準(zhǔn)確判斷蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。為進一步提高實驗結(jié)果的可靠性，將圖1中8塊膠上蛋白表達(dá)量相對較高的幾個樣品，再次進行SDS-PAGE電泳檢測(見圖2)。結(jié)果表明，目的蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：誘導(dǎo)溫度16 ℃，IPTG濃度300 mmol/L，誘導(dǎo)時間20 h。

(a),(b),(c)：溫度為16 ℃條件下，IPTG濃度分別為100、300、500 mmol/L，誘導(dǎo)時間分別為8、10、12、13.5、20、22 h時的目的蛋白表達(dá); (d),(e),(f)：溫度為28 ℃條件下，IPTG濃度分別為100、300、500 mmol/L，誘導(dǎo)時間分別為8、10、12、13.5、20、22 h時的目的蛋白表達(dá); (g),(h)：溫度為37 ℃條件下，IPTG濃度分別為100、300、500 mmol/L，誘導(dǎo)時間分別為3、4、5、6、7 h時的目的蛋白表達(dá)

圖1 IPTG不同誘導(dǎo)溫度、不同誘導(dǎo)時間、不同誘導(dǎo)濃度條件下目的蛋白的表達(dá)

圖2 篩選出15種不同IPTG誘導(dǎo)條件下目的蛋白的表達(dá)

4.2 Ni親和層析及SDS-PAGE檢測

目的蛋白N端帶有His標(biāo)簽，能特異性的結(jié)合在Ni柱上。用不同濃度的咪唑緩沖液進行洗脫，由于不同蛋白及雜質(zhì)結(jié)合能力不同，因此通過此步可以獲得初步純化的目的蛋白。根據(jù)監(jiān)測圖(見圖3)，紫外吸收從48管開始有升高跡象，在第51、52、53管達(dá)到峰值，到55管恢復(fù)到基線。于是對48、50、52、54和55管中的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳檢測(見圖4)。實驗結(jié)果表明，鎳柱親和純化效果較好，目的蛋白樣品中存在少許雜蛋白；通過與Marker比較，目的蛋白分子量大小約為41 kDa，與理論值相符；第50～55管中的目的蛋白比較富集且純度較高，收集這6管蛋白，濃縮至1 mL，待進一步純化處理。

圖3 Ni親和層析監(jiān)測圖

圖4 Ni柱親和層析純化得到的目的蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果

4.3 離子交換層析及SDS-PAGE檢測

目的蛋白的等電點為5.03，在pH為8.0的緩沖液中帶負(fù)電荷，故選用陰離子交換柱。根據(jù)監(jiān)測圖(見圖5)，對32～38管中的蛋白樣品進行濃縮，體積不大于5 mL。此步操作，由于學(xué)生時間關(guān)系，簡化了SDS-PAGE電泳檢測。實際上不應(yīng)該省略此步，因為根據(jù)SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果進行蛋白樣品收集，收集到的蛋白樣品更加富集、純度高，后續(xù)純化效果更佳。

圖5 陰離子交換層析監(jiān)測圖

4.4 凝膠過濾層析及SDS-PAGE檢測

將上述濃縮的蛋白樣品進一步經(jīng)凝膠過濾層析純化，從監(jiān)測圖(見圖6)可以看出，出現(xiàn)兩個紫外吸收峰。從出峰時間和峰面積大致判斷后面的主峰應(yīng)該是目的蛋白峰，前面的小峰可能是分子量較大的雜蛋白。取35、37、39、41和43管進行SDS-PAGE電泳檢測(見圖7)。結(jié)果顯示，目的蛋白樣品純度很高，達(dá)到了分離純化的目的。

圖6 凝膠過濾層析監(jiān)測圖

圖7 凝膠過濾層析純化得到的目的蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果

4.5 蛋白濃縮及濃度檢測

取凝膠過濾層析39、40、41這3個收集管中的蛋白樣品，濃縮至約400 μL，用nano drop 2000檢測蛋白濃度，濃度為54 mg/mL，表明1 L大腸桿菌最終得到了約21.6 mg的高純度目的蛋白。

5 教學(xué)組織

(1) 實驗進度安排。由于伯苓班同學(xué)在大二上半學(xué)期剛接觸到生物化學(xué)基礎(chǔ)理論知識和實驗技能的學(xué)習(xí)，因此該綜合性實驗的開展安排在實驗課中后期。此時學(xué)生理論課上學(xué)習(xí)了蛋白質(zhì)、核酸等基本理論，實驗課上學(xué)習(xí)了SDS-PAGE電泳、凝膠過濾層析、離心、分光光度等技術(shù)，具備了一定的生物化學(xué)基本理論和操作技能。作為基礎(chǔ)實驗課的一種拓展和提升，該綜合性實驗具有一定的探究性，需要學(xué)生付出一定的時間和精力進行鉆研，因此安排實驗課中后期約6周時間，學(xué)生可以充分利用業(yè)余時間或?qū)嶒炚n上等待間隙，通過查閱文獻資料或與教師探討，了解實驗?zāi)康暮鸵饬x、提出解決方案、自主實驗、完成成果展示等。

(2) 項目為開放性選修項目。為尊重伯苓班同學(xué)的個性化發(fā)展和學(xué)術(shù)志趣，與科研實驗室緊密合作，開發(fā)了多項符合學(xué)生認(rèn)知水平和操作能力的、具有一定探究性質(zhì)的綜合性實驗項目，本項目只是其中之一。學(xué)生可根據(jù)自身興趣，自由選題。為保證教學(xué)效果，項目人數(shù)控制在4或5人。學(xué)生以團隊形式，自主制定實驗計劃和進度安排[5]，應(yīng)用既有知識和技能解決實際問題。實驗室則為學(xué)生積極營造鼓勵獨立思考、自由探索、勇于創(chuàng)新的開放式教學(xué)環(huán)境[6]。

(3) 研討課。最后一次實驗課結(jié)束后，進行綜合性實驗PPT展示。目的有兩個：① 通過PPT制作，促進學(xué)生對實驗進行分析、總結(jié)和反思，通過理論知識與實踐知識相互融合，使學(xué)生對所學(xué)知識有著更加透徹的認(rèn)知和理解[7]，并通過觸類旁通，形成自己的知識體系；② 通過PPT展示，培養(yǎng)學(xué)生交流和表達(dá)能力，使學(xué)生能夠清晰、科學(xué)地描述問題，準(zhǔn)確表達(dá)觀點，初步掌握學(xué)術(shù)交流能力[8]。且在研討過程中，鍛煉學(xué)生推理、應(yīng)變、思辨的能力，提高綜合素質(zhì)。

6 教學(xué)效果

6.1 激發(fā)學(xué)生科研興趣

該綜合實驗項目兼具兩大優(yōu)點：

(1) 實用性。學(xué)生需要利用已有的生物化學(xué)理論知識和實驗技能儲備，通過查閱相關(guān)文獻資料，為科研實驗室課題組獲得高濃度、高純度的蛋白樣品提供可靠的最佳誘導(dǎo)條件。能夠靈活運用所學(xué)知識幫助科研實驗室解決實際問題，讓學(xué)生很有成就感，大大激發(fā)了他們參與科研的興趣。

(2) 挑戰(zhàn)性。由于生物大分子樣品需要95%或更高的純度才易結(jié)晶，樣品中的任何雜質(zhì)都可能與大分子發(fā)生作用，影響晶體的生成[9]，因此要獲得滿足要求的、高質(zhì)量的蛋白樣品，對學(xué)生來講，充滿挑戰(zhàn)。對于不愿意按部就班的伯苓班同學(xué)來講，該項目充滿吸引力，學(xué)生興趣濃厚，整個實驗過程中參與的積極性非常高。同時，該項目組同學(xué)的參與，也給其他同學(xué)帶來了一定的“攀比壓力”，伯苓班同學(xué)紛紛主動走進科研實驗室，整個班級科研氛圍濃厚。

6.2 培養(yǎng)學(xué)生科研能力

(1) 培養(yǎng)學(xué)生自學(xué)能力。由于項目來自于科研課題，實驗開展過程中，沒有教師的講授、沒有可參考的教材，學(xué)生必須通過自己查閱相關(guān)的文獻資料或與教師探討，才能對實驗原理、實驗設(shè)計思路和方法有比較深入、透徹的理解，這需要學(xué)生有較強的自學(xué)能力。且在不斷地以理論指導(dǎo)實踐，以實踐檢驗理論的實驗實踐中，學(xué)生通過對知識不斷進行歸納、總結(jié)、分析，自主建構(gòu)知識體系的能力也得到培養(yǎng)。

(2) 掌握多項實驗技能。本文的實驗結(jié)果全部來自學(xué)生的實驗結(jié)果，通過這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)學(xué)生實踐動手能力尚存在一定的欠缺。通過該綜合性實驗，學(xué)生擁有了更多操作、實踐的機會，譬如通過鍛煉，學(xué)生的SDS-PAGE操作基本功越來越扎實。同時，學(xué)生通過實驗，也學(xué)到了很多其他實驗技能，如：無菌操作、蛋白誘導(dǎo)表達(dá)以及蛋白純化系統(tǒng)里涉及的多項層析技術(shù)等。這些技能的獲得，將有利于他們在科研實驗室自主開展相關(guān)的課題研究，擺脫以往只能給師兄、師姐洗瓶子等打下手的窘境。

(3) 培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識。在該綜合實驗的實施過程中，遇到了很多實際問題。譬如對IPTG不同誘導(dǎo)溫度、不同誘導(dǎo)濃度、不同誘導(dǎo)時間的菌體取樣后，樣品處理起初是菌體沉淀用50 μL buffer懸浮后，加入等體積的2×Protein SDS PAGE Loading Buffer，煮沸5 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)煮沸后的溶液太過黏稠，導(dǎo)致SDS-PAGE的上樣量誤差很大，結(jié)果不可靠。后來學(xué)生提出改進意見：① 加大體系的量；② 上樣前進行離心。后經(jīng)學(xué)生自己實驗探索，效果很好，在后續(xù)實驗中采用了學(xué)生改進的方法。整個實驗圍繞“獲得高純度、高得率的目的蛋白”展開，在解決實際問題的過程中，學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、解決問題的能力得到不斷鍛煉。而問題解決的過程本就是一種創(chuàng)新，學(xué)生不斷解決問題的過程就是創(chuàng)新意識培養(yǎng)的過程[10]。

(4) 啟發(fā)學(xué)生思考，形成批判性思維。在PPT制作過程中，學(xué)生會對實驗原理進行深究、對實驗結(jié)果會進行深入的分析與討論、對實驗的整體設(shè)計思路進行回顧與總結(jié)，這無形中達(dá)到了啟發(fā)學(xué)生思考的目的。此外，PPT展示結(jié)束，學(xué)生間、老師和學(xué)生間的問答，更是大大促進了學(xué)生思考和批判性思維的形成。譬如其他同學(xué)提問的問題有：① 初次養(yǎng)菌，發(fā)現(xiàn)疑似噬菌體感染，如何發(fā)現(xiàn)的？怎么解決菌種問題？② 從實驗結(jié)果看，并不是IPTG濃度越高，蛋白誘導(dǎo)表達(dá)量越高，為什么？③ 不同的SDS-PAGE膠由于染色、脫色程度不一樣，如何對不同的取樣蛋白樣品進行量化比較，從而選出最佳誘導(dǎo)條件？④ 應(yīng)用蛋白純化系統(tǒng)進行蛋白純化時，為什么要對收集的蛋白樣品進行濃縮，然后再進行下一步純化？一個個問題的提出，點燃了同學(xué)間思想火花的碰撞，潛移默化中孕育創(chuàng)新的種子。

6.3 培養(yǎng)學(xué)生團隊合作精神

為提高伯苓班實驗課的教學(xué)效果，在授課方式上采取單人操作的方式，賦予學(xué)生更多自主探索的實踐機會、便于師生互動，這也是目前拔尖人才培養(yǎng)實驗教學(xué)中普遍采用的一種教學(xué)方式[11-13]。但是許多創(chuàng)新成果往往需要團隊合作才能產(chǎn)生，因而也不可忽視學(xué)生團隊合作意識、溝通能力以及組織能力的鍛煉與培養(yǎng)。本文提出的綜合性實驗項目，需要伯苓班同學(xué)以小團隊的形式，來完成實驗?zāi)繕?biāo)。團隊不指定負(fù)責(zé)人，形成“人人參與，人人負(fù)責(zé)”的團隊運行模式。這對心氣高的伯苓班同學(xué)來講，如何以團隊的力量來圓滿完成這樣一項具有自主、合作、探究性質(zhì)的實驗項目也是一種挑戰(zhàn)。而實驗項目有計劃、有步驟的順利進行,包括以團隊形式進行的PPT展示，表明學(xué)生在分工合作過程中對團隊合作精神有了重新的認(rèn)識，溝通能力、組織能力也得到了很好的鍛煉。

7 結(jié) 語

通過教學(xué)-科研緊密結(jié)合，課程組為學(xué)生設(shè)計了“目的蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件的確定及其純化”這個綜合性實驗項目，旨在教學(xué)實踐中滲入科研的內(nèi)容和方式，充分利用研究項目等科研資源來提高本科教育質(zhì)量，促進學(xué)生的綜合運用和創(chuàng)新能力[14]，并使學(xué)生實現(xiàn)自主學(xué)習(xí)并獲得研究素質(zhì)和能力[15]。經(jīng)2016級伯苓班25位同學(xué)的實施，取得了很好的教學(xué)效果，同學(xué)們給予了高度評價。該綜合性實驗項目既體現(xiàn)學(xué)科發(fā)展前沿，又涉及多項生物化學(xué)基礎(chǔ)實驗知識和技能的綜合運用，且具有一定的探究性和挑戰(zhàn)性，適于作為訓(xùn)練拔尖人才科研能力的生物化學(xué)綜合性實驗項目，進行推廣。同時，以科學(xué)研究促進教學(xué)進步，對于拔尖人才創(chuàng)新能力培養(yǎng)是一個很好的思路，值得借鑒和思考。