葛 青，沈 煒，章亭洲,2*

（1.浙江科峰生物科技有限公司，浙江 海寧 314400；2.浙江工商大學(xué)，杭州 310000）

豆粕是目前飼料工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)使用量很大的一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料[1-2]。與菜籽粕、棉籽粕、花生粕相比，豆粕具有氨基酸平衡（賴氨酸含量高、接近理想氨基酸模式）、消化率高、適口性好等特點；與動物源性蛋白質(zhì)飼料（如魚粉、肉骨粉、血漿蛋白質(zhì)粉等）相比，豆粕具有貨源充足、不易被病原菌污染或氧化腐敗、安全系數(shù)高等特點[3-4]。但是，豆粕中也含有一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，如胰蛋白質(zhì)酶抑制因子、β球蛋白質(zhì)等[5]。這些抗?fàn)I養(yǎng)因子對斷奶仔豬的腸道結(jié)構(gòu)具有很大的破壞作用，并易引起仔豬腹瀉。因此，開發(fā)廉價的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)源對飼料工業(yè)、畜牧業(yè)具有重要意義。

大米蛋白質(zhì)渣的蛋白質(zhì)含量高于大豆，品質(zhì)優(yōu)良，氨基酸組成合理，賴氨酸含量高于其他谷類，生物價（BV）和蛋白質(zhì)效用比率（PER）高，且具有低過敏性，對固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)動物飼料具有重要意義[6]。此外，大米蛋白質(zhì)渣資源豐富、價格低廉[7]。本試驗研究添加不同比例的大米蛋白質(zhì)渣對發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響，通過對固態(tài)發(fā)酵條件的控制和粗蛋白質(zhì)等指標(biāo)的跟蹤檢測，探討發(fā)酵過程的規(guī)律，從而優(yōu)化發(fā)酵工藝，為進(jìn)一步提高發(fā)酵豆粕品質(zhì)提供參考[8-9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米蛋白質(zhì)渣：桐鄉(xiāng)市康源生物制品有限公司提供。豆粕：中海糧油集團(tuán)有限公司提供。假絲酵母、乳酸菌、枯草芽孢桿菌：浙江科峰生物科技有限公司提供。

氫氧化鈉、亞硝酸鈉、乙醇、濃硫酸、三氯乙酸、硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅、溴甲酚綠、硼酸等均為分析純。

1.2 主要儀器

PTX-FA210 電子天平：福州華志科學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度計（UV-5500PC 型）：上海市元析儀器有限公司；KQ-300E 型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；SW-CJ-1Bu 型單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；GZX-9140MBE 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Allegra X-12R 離心機(jī)：貝克曼庫爾特有限公司；SPX-B-Z 生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DF-101S磁力加熱攪拌器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；MB45 型水分測定儀：美國奧豪斯儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大米蛋白質(zhì)渣發(fā)酵菌株的篩選

取大米蛋白質(zhì)渣100 g 放置于托盤中，105 ℃滅菌15 min，按接種量10%分別加入枯草芽孢桿菌、假絲酵母、乳酸菌的種子液，同時加入滅菌水至飼料總含水量為40%，攪拌均勻后于30 ℃恒溫培養(yǎng)，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵48 h，每組3 個重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵飼料于60 ℃烘干，粉碎過60目篩后，測定發(fā)酵飼料中粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維、酸溶蛋白質(zhì)、乳酸以及水分含量。

1.3.2 粗蛋白質(zhì)的測定

粗蛋白質(zhì)含量的測定參照國標(biāo)GB/T 6432-94。

1.3.3 水分的測定

取1.5 g樣品，通過MB45型水分測定儀，測定其含水率。

1.3.4 酸溶蛋白質(zhì)的測定

試樣用一定濃度的三氯乙酸溶液提取，經(jīng)離心分離后，用凱氏定氮法測定上清液中粗蛋白質(zhì)的含量。

1.3.5 粗纖維的測定

粗纖維含量的測定參照國標(biāo)GB/T 6434-2006。

1.3.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

單因素發(fā)酵條件優(yōu)化實驗：采取單因素試驗法分別對大米添加量（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、發(fā)酵溫度（26、28、30、32、34 ℃）、接種量（6%、8%、10%、12%、14%、16%）和發(fā)酵時間（30、36、42、48 、54、60 h）等不同的條件因子進(jìn)行了研究。

正交實驗優(yōu)化：根據(jù)單因素的實驗結(jié)果，對篩選得到的4 個因素（A-大米添加量，B-發(fā)酵溫度，C-接種量，D-發(fā)酵時間），每個因素設(shè)3個水平，即采用L9（34）正交實驗，對發(fā)酵條件組合進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株對大米蛋白質(zhì)發(fā)酵飼料成分的影響

不同菌株對大米蛋白質(zhì)發(fā)酵飼料成分的影響結(jié)果見表1。

由表1 可知，本試驗中假絲酵母對大米蛋白質(zhì)發(fā)酵飼料中粗蛋白質(zhì)的提高程度最大，其次為枯草芽孢桿菌，最后是乳酸菌。假絲酵母對飼料中纖維的降解程度也高于其他菌株，對中性洗滌纖維的降解率達(dá)到19.46%。相較于枯草芽孢桿菌和酵母菌，乳酸菌的產(chǎn)乳酸能力較強(qiáng)，發(fā)酵48 h后飼料中乳酸含量達(dá)到101.08 mmol·kg-1。為實現(xiàn)降低飼料抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高飼料中蛋白質(zhì)含量的效果，本研究采用假絲酵母進(jìn)行發(fā)酵試驗。

表1 不同菌株對大米蛋白質(zhì)發(fā)酵飼料成分的影響

2.2 發(fā)酵對添加大米粉豆粕感官指標(biāo)的影響

2.2.1 顏色和物理形態(tài)

與對照組相比，添加大米蛋白質(zhì)渣可使發(fā)酵豆粕顏色加深，呈紅黃色，并可使發(fā)酵豆粕物理性狀偏緊密，可能是因為大米蛋白質(zhì)渣發(fā)黏，透氣性不好導(dǎo)致的。

2.2.2 氣味

與對照組相比，添加大米蛋白質(zhì)渣以后可以改善發(fā)酵豆粕的氣味。添加大米蛋白質(zhì)渣組有一些淡淡的清香味。各處理組相比，豆粕與大米蛋白質(zhì)渣質(zhì)量比為7：3組氣味較好。

2.3 添加大米蛋白質(zhì)渣對發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響

2.3.1 添加大米蛋白質(zhì)渣對發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)含量的影響

大米蛋白質(zhì)渣添加量對粗蛋白質(zhì)的影響見圖1。

圖1 大米蛋白質(zhì)渣對粗蛋白質(zhì)含量的影響

由圖1 可知，大米蛋白質(zhì)渣添加量對粗蛋白質(zhì)的影響不是很顯著，相對而言，大米蛋白質(zhì)渣添加量為30%時，粗蛋白質(zhì)含量較高，這可能是由于添加適量的大米蛋白質(zhì)渣，可促進(jìn)酵母菌的增殖，進(jìn)而促進(jìn)菌體蛋白質(zhì)的合成。因此，選擇大米蛋白質(zhì)渣添加量為30%。

2.3.2 添加大米蛋白質(zhì)渣對發(fā)酵豆粕酸溶蛋白質(zhì)的影響

在發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間48 h、接種量10%的條件下，研究大米蛋白質(zhì)渣添加量（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）對發(fā)酵豆粕酸溶蛋白質(zhì)含量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 大米蛋白質(zhì)渣對酸溶蛋白質(zhì)含量的影響

由圖2 可知，大米蛋白質(zhì)渣添加量為30%時，酸溶蛋白質(zhì)含量最高，顯著高于對照組以及10%、20%、60%、70%處理組（P＜0.05）。

2.3.3 添加大米蛋白質(zhì)渣對發(fā)酵豆粕粗纖維的影響

在發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間48 h，接種量10%的條件下，研究大米蛋白質(zhì)渣添加量（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）對發(fā)酵豆粕酸溶蛋白質(zhì)含量的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 大米蛋白質(zhì)渣對粗纖維含量的影響

由圖3 可知，隨著大米蛋白質(zhì)渣的增加，粗纖維的含量逐漸下降。大米蛋白質(zhì)渣添加量為0、10%、20%、30%時差異不顯著（P＞0.05）。

2.3.4 發(fā)酵溫度對添加大米蛋白質(zhì)渣發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)含量的影響

在大米蛋白質(zhì)渣添加量20%、發(fā)酵時間48 h、接種量10%的條件下，研究發(fā)酵溫度（26、28、30、32、34 ℃）對發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)含量的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對粗蛋白質(zhì)含量的影響

由圖4 可知，隨著發(fā)酵溫度的提高，粗蛋白質(zhì)含量先增加再下降，發(fā)酵溫度30 ℃時粗蛋白質(zhì)含量最高。

2.3.5 接種量對添加大米蛋白質(zhì)渣發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)含量的影響

在大米蛋白質(zhì)渣添加量20%，發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度30 ℃的條件下，研究接種量（6%、8%、10%、12%、14%、16%）對發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)含量的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 接種量對粗蛋白質(zhì)含量的影響

由圖5 可知，隨著接種量的增加，粗蛋白質(zhì)含量先增加再下降，接種量為10%時粗蛋白質(zhì)含量最高。

2.3.6 發(fā)酵時間對添加大米蛋白質(zhì)渣發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)含量的影響

在大米蛋白質(zhì)渣添加量20%，接種量10%，發(fā)酵溫度30 ℃的條件下，研究發(fā)酵時間（30、36、42、48、54、60 h）對發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)含量的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 發(fā)酵時間對粗蛋白質(zhì)含量的影響

由圖6 可知，隨著發(fā)酵時間的增加，粗蛋白質(zhì)含量先增加再下降，發(fā)酵時間48 h 時粗蛋白質(zhì)含量最高。

2.4 正交實驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，采用L9（34）的正交實驗，以粗蛋白質(zhì)為參考指標(biāo)，研究大米蛋白質(zhì)渣添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量對發(fā)酵豆粕的影響，每個試驗進(jìn)行3次。正交實驗因素水平表見表2。

添加大米蛋白質(zhì)渣對發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)含量的影響的正交實驗結(jié)果及極差分析見表3，數(shù)據(jù)處理采用直觀分析方法，以極差大小確定因素主次順序。

從表3 中極差分析可知，影響粗蛋白質(zhì)含量的主要因素是大米蛋白質(zhì)渣添加量，其次是發(fā)酵溫度和接種量，發(fā)酵時間對粗蛋白質(zhì)的含量的影響最小。最佳發(fā)酵條件組合為A2B3C3D2，即大米蛋白質(zhì)渣添加量為30%、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量10%、發(fā)酵時間48 h。

在最佳條件下進(jìn)行驗證實驗，平行實驗3 次，測得粗蛋白質(zhì)含量59.23%，該結(jié)果高于單因素實驗最佳條件的得率。說明各因素間相互作用可以提高發(fā)酵粗蛋白質(zhì)含量，達(dá)到更好的發(fā)酵效果。

表2 正交實驗因數(shù)水平表L9（34）

表3 正交實驗結(jié)果

4 結(jié)論

本試驗研究了添加大米蛋白質(zhì)渣對發(fā)酵豆粕品質(zhì)的影響，采用單因素實驗和正交實驗對發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件為：大米蛋白質(zhì)渣添加量為30%、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量10%、發(fā)酵時間48 h。在此最佳發(fā)酵條件下測得粗蛋白質(zhì)含量59.23%。本研究以農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)品為主要原料固體發(fā)酵生產(chǎn)動物飼料，可為農(nóng)業(yè)廢棄物的飼料化進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用范圍。