趙 剛，閆 冰，劉鑫瑩

（哈藥集團生物疫苗有限公司，哈爾濱 150000）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）主要侵害繁殖母豬和仔豬，引起母豬繁殖障礙、仔豬的呼吸道疾病和較高的死亡率。PRRS 的暴發(fā)蔓延，給世界各國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，在中國每年有200 萬頭豬感染，近40 萬頭豬死亡。目前尚無針對該病的有效治療藥物，開發(fā)高效、安全、廉價的病毒疫苗是預(yù)防、控制PRRSV 感染的唯一可行辦法。目前國內(nèi)Marc-145 細(xì)胞制備豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征病毒均采用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝，由于受到轉(zhuǎn)瓶表面積和培養(yǎng)條件的限制，生產(chǎn)細(xì)胞密度低，勞動強度大，操作過程易污染，疫苗質(zhì)量難以得到保證。本研究采用細(xì)胞生物反應(yīng)器技術(shù)生產(chǎn)PRRSV 抗原，并對培養(yǎng)過程中的各項技術(shù)條件進行優(yōu)化，從而總結(jié)出一套較為合理的生產(chǎn)工藝，為PRRSV的大規(guī)模培養(yǎng)提供可靠的參考數(shù)據(jù)。

1 試驗材料

1.1 細(xì)胞及病毒

Marc-145 細(xì)胞（購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），PRRSV HuN4-F112株（購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）。

1.2 主要試劑

MEM 培養(yǎng)基（購自GIBCO 公司）；新生牛血清（購自濟南勁牛生物科技有限公司）；微載體Cytodex-1（購自德國GE 公司）；胰蛋白酶（購自美國Sigma 公司）；結(jié)晶紫細(xì)胞裂解液（哈藥集團生物疫苗有限公司研發(fā)中心配制）。

2 試驗方法

2.1 Marc-145細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)

將細(xì)胞凍存管自液氮罐中取出，置于37 ℃水浴，使管內(nèi)凍存液迅速融化。常溫1 000 r·min-1離心5 min。棄去上清，用少量細(xì)胞生長液將細(xì)胞重懸后移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入10 mL 細(xì)胞生長液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞長成單層后，用胰酶-EDTA 消化液消化，并按1:3進行擴增培養(yǎng)。

2.2 PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的增值

Marc-145 細(xì)胞是PRRSV 的敏感細(xì)胞，病毒液不用激活。取已長成致密單層的細(xì)胞，棄掉其中的生長液，用不含血清的DMEM 洗細(xì)胞面3 次。吸凈殘余的維持液，加入PRRSV 病毒液0.2 mL，37 ℃吸附60 min，其間搖晃1 次·20 min-1，使病毒均勻、充分地吸附到細(xì)胞上。加入10 mL 的維持液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，當(dāng)80%的細(xì)胞出現(xiàn)病變時收獲病毒。將收獲的病毒液于-20～37 ℃反復(fù)凍融3 次，保存于-80℃冰箱。

2.3 微載體預(yù)處理

稱取所需質(zhì)量的微載體Cytodex-1，按100 mL:1 g 的比例用PBS 浸泡微載體，輕微攪拌使微載體均勻浸泡3 h，121 ℃、滅菌30 min；倒掉PBS，以30 mL:1 g 的比例用培養(yǎng)基將微載體洗滌2 次，將微載體放置在4 ℃冰箱內(nèi)平衡過夜，待用。

2.4 微載體細(xì)胞計數(shù)

取1 mL 含微載體的培養(yǎng)液，900 r·min-1離心5 min，后棄掉上清液，加入與上清液相同體積的0.1%結(jié)晶紫溶液，混勻后于37 ℃中孵育1 h，然后用血球計數(shù)板計數(shù)釋放出來的細(xì)胞核，即為1 mL培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)。

2.5 病毒含量測定

將病毒液作連續(xù)10倍稀釋，取1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7和1×10-85 個稀釋度，分別接種已長成良好單層Marc-145 細(xì)胞、棄去細(xì)胞培養(yǎng)液的96孔細(xì)胞板中，每個稀釋度接種6 孔，100 μL·孔-1，同時設(shè)正常細(xì)胞對照，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，逐日觀察細(xì)胞病變情況，并記錄細(xì)胞病變的孔數(shù)，按Reed-Muench法計算TCID50。

2.6 微載體培養(yǎng)PRRSV試驗條件的優(yōu)化

2.6.1 病毒維持液中血清濃度的確定

以4.0×105cells·mL-1的密度接種Marc-145 細(xì)胞，微載體Cytodex-1 的用量為4 g·L-1，待細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，停止攪拌，靜置使微載體沉淀，吸出上清液，用DMEM 洗滌3 次，按感染復(fù)數(shù)為0.1 的量加入PRRSV 病毒液，然后分別加入血清濃度為1%、2%、3%的病毒維持液，于不同時間取樣測定病毒含量。確定病毒維持液中血清濃度。

2.6.2 病毒接毒時間的確定

以4×105cells·mL-1的密度接種細(xì)胞，微載體Cytodex-1 的用量為4 g·L-1，分別在細(xì)胞培養(yǎng)24、48 和72 h 后，停止攪拌，靜置使微載體沉淀，吸出上清液，用DMEM 洗滌3 次，按感染復(fù)數(shù)為0.1的量加入PRRSV 病毒液，最后加入血清濃度為2%的病毒維持液，于不同時間取樣測定病毒含量。確定最適的接毒時間。

2.6.3 感染復(fù)數(shù)（MOI）及最佳收獲時間的確定

以4×105cells·mL-1的密度接種細(xì)胞，微載體Cytodex-1 的用量為4 g·L-1，細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后，停止攪拌，靜置后吸出上清液，用DMEM 洗滌3 次，分別按感染復(fù)數(shù)為0.20、0.05 和0.01 的量加入PRRSV，最后加入血清含量為2%的病毒維持液，于不同時間取樣測定病毒含量。確定感染復(fù)數(shù)及最適收毒時間。

2.7 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)Marc145細(xì)胞增殖PRRSV

將Marc145 細(xì)胞擴大培養(yǎng)，增殖至10 L 轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)72 h 后，細(xì)胞匯合度＞90%，按每個轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞數(shù)為2.6×108個·mL-1、MOI 為0.05 進行PRRSV接種培養(yǎng)。病毒接種后48 h收獲，并進行病毒含量的測定。

3 結(jié)果與分析

3.1 PRRSV在Marc-145細(xì)胞上的增殖

PRRSV感染Marc-145細(xì)胞見圖1。

由圖1 可知，正常的Marc-145 細(xì)胞于傳代后3 d 即可長成致密單層，透光性好、立體感強、界限清晰；接種PRRSV 后12 h，出現(xiàn)細(xì)胞病變，細(xì)胞界限模糊、透光性變差、細(xì)胞融合拉網(wǎng)、圓縮脫落。

圖1 PRRSV感染Marc-145細(xì)胞

圖2 維持液中血清濃度對病毒增殖的影響

3.2 病毒維持液中血清濃度的確定

當(dāng)病毒維持液中血清濃度分別為1%、2%、3%時，于不同時間取樣測定病毒含量結(jié)果見圖2。

由圖2 可知，用血清濃度為1%的病毒維持液培養(yǎng)時病毒滴度較低；維持液血清濃度為2%、3%，對病毒滴度影響不明顯，病毒滴度均較高。綜合考慮本試驗維持液中血清濃度采用2%。

3.3 接毒時間的確定

分別在細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h 后接毒，于不同時間取樣測定病毒含量結(jié)果見圖3。

圖3 感染時間對病毒增殖的影響

由圖3 可知，在細(xì)胞培養(yǎng)24 h 時細(xì)胞貼球率為40%，病毒滴度最低；在細(xì)胞生長最高峰72 h 時，細(xì)胞貼球率＞90%，接毒后病毒滴度最高為106.2TCID50·mL-1。由此可見PRRSV 增殖的效果與接毒時的細(xì)胞生長情況有關(guān)，接毒時細(xì)胞數(shù)量愈大，病毒滴度愈高，反之則較低。

3.4 感染復(fù)數(shù)（MOI）和收毒時間的確定

不同感染復(fù)數(shù)對PRRSV 增殖的影響結(jié)果見圖4。

圖4 感染復(fù)數(shù)對病毒增殖的影響

由圖4 可知，過高或過低的感染復(fù)數(shù)（0.50 和0.01）均導(dǎo)致較低的病毒滴度，說明接毒劑量直接影響病毒的增殖效率。感染復(fù)數(shù)為0.05 時可獲得最高的PRRSV 增殖效價，達到106.4TCID50·mL-1。此外各組試驗結(jié)果均顯示，接毒后48 h 的病毒效價均高于接毒后72 h的病毒效價，說明接毒后48 h可以作為收獲病毒的最適時間。

3.5 不同培養(yǎng)系統(tǒng)中病毒含量的比較

試驗結(jié)果可知，反應(yīng)器生產(chǎn)病毒含量為106.6TCID50·mL-1、轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)病毒含量為106.3TCID50·mL-1。表明用反應(yīng)器生產(chǎn)病毒毒價比轉(zhuǎn)瓶高。

4 討論

病毒維持液中血清濃度的比較試驗表明，使用維持液中血清含量1%不利于細(xì)胞的生長和繁殖，因此收獲的病毒滴度也較低；血清含量2%、3%的對細(xì)胞生長最為有利，獲得的毒價較高，但毒價差別不大。血清濃度也不能過高，血清濃度過高血清掩蔽了病毒與細(xì)胞的結(jié)合位點，導(dǎo)致病毒與細(xì)胞結(jié)合受阻，從而影響病毒的增殖。本試驗選擇最適的血清濃度為2%，因為此濃度下即保證細(xì)胞生長繁殖所需的營養(yǎng)，利于病毒毒價的提高，又可降低成本。

接毒時間過早，細(xì)胞處于生長早期，細(xì)胞數(shù)量較少，產(chǎn)生的病毒滴度也較少；如果接毒過晚，微載體上細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞處于衰老階段，同樣影響病毒的增殖。在細(xì)胞生長到72 h時細(xì)胞數(shù)達到最大，接毒時產(chǎn)生的病毒含量最高。由此可見PRRSV增殖的效果與接毒時的細(xì)胞生長情況有關(guān)，接毒時細(xì)胞數(shù)量愈大，病毒滴度愈高，反之則較低。

感染復(fù)數(shù)（MOI）即單個細(xì)胞感染病毒的顆粒數(shù)，由此可確定接種病毒的劑量。MOI值可通過測定病毒感染性滴度和接種細(xì)胞的個數(shù)獲得。本研究以不同MOI 感染Marc-145 細(xì)胞，分析其對病毒滴度的影響。本研究中0.05 的感染復(fù)數(shù)最為匹配PRRSV 感染及增殖過程的要求，試驗結(jié)果表明，過高或過低的接毒量均不利于PRRSV 的增殖，其具體內(nèi)在機理可能與Marc-145 細(xì)胞上PRRSV 的受體蛋白質(zhì)表達豐度存在顯著相關(guān)，有待深入研究。

試驗研究了反應(yīng)器、轉(zhuǎn)瓶不同培養(yǎng)系統(tǒng)生產(chǎn)PRRSV。結(jié)果表明，用轉(zhuǎn)瓶與反應(yīng)器生產(chǎn)病毒毒價相近，病毒含量分別為106.7和106.3TCID50·mL-1。由于本文所研究的工藝是要適合于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，因此必須從操作的便利、成本以及最終效果來確定。