何梅英，陳文婷

0 引言

膿毒癥是臨床常見的急危重癥，其激發(fā)的全身炎癥綜合征是伴發(fā)多器官功能障礙的重要原因，其中肺臟是最易受損的器官。膿毒癥早期往往可導(dǎo)致急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)的發(fā)生。ALI是急性呼吸窘迫綜合征的早期階段，如果不加干涉病死率高達(dá)50%～70%[1]。膿毒癥伴發(fā)的全身嚴(yán)重炎癥反應(yīng)是急性肺損傷的主要發(fā)病機(jī)制，抑制炎癥，保護(hù)肺功能也是目前預(yù)防膿毒癥大鼠急性肺損傷的主要策略[2]。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種非黃酮類多酚化合物，為中藥虎杖根莖的提取物，藥理學(xué)研究顯示，白藜蘆醇具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗炎等多種功效[3]。研究顯示，白藜蘆醇對膿毒癥大鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用[4]。本研究觀察白藜蘆醇對膿毒癥大鼠核因子κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路的影響，探討白藜蘆醇對膿毒癥大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級健康雄性成年SD大鼠由海南醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，體重200～250 g，共60只，無菌飲水和飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，進(jìn)行造模處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)造模 60只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(20只)和造模組(40只)，造模組SD大鼠采用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)制備膿毒癥模型[5]，方法如下：經(jīng)腹注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，備皮消毒后，沿腹正中線做1 cm切口，游離盲腸末端，距盲腸末端1 cm處用4號無菌絲線結(jié)扎，27號針頭貫通盲腸腸管，擠出少量腸內(nèi)容物后，將盲腸還納腹腔，逐層縫合關(guān)閉腹腔，術(shù)后皮下注射生理鹽水抗休克治療。假手術(shù)組SD大鼠僅分離盲腸，不做結(jié)扎和穿孔。術(shù)后40只造模SD大鼠隨機(jī)分為膿毒癥模型組和白藜蘆醇干預(yù)組，每組20只，干預(yù)組大鼠于術(shù)后60 min尾靜脈注射無菌白藜蘆醇(40 mg/kg，美國Sigma公司)，其余大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。24 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.3 大鼠外周血腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的檢測 ELISA法檢測大鼠外周血TNF-α、IL-6的表達(dá)。所有實(shí)驗(yàn)SD大鼠造模前及造模24 h后抽取尾靜脈血液0.5 ml，1 000 r/min離心10 min，分離上層血清，送檢驗(yàn)科使用TNF-α和IL-6 ELISA檢測試劑盒(武漢華美公司產(chǎn)品，批號：20171104)，加入相關(guān)試劑，DNM-9606酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)檢測各樣品的吸光度值變化，對照試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品，計算出各樣品TNF-α和IL-6的相對表達(dá)水平。

1.4 肺損傷評分 各組大鼠造模24 h后，斷頸處死，開胸留取肺組織，4%甲醛固定后，送檢驗(yàn)科經(jīng)石蠟包埋、脫水后，制作HE染色切片，顯微鏡下進(jìn)行肺損傷評分，參照卜克等[2]的方法，從肺泡水腫、肺泡出血、肺不張、炎癥細(xì)胞浸潤、透明膜形成5個方面，按照正常(0分)、輕度(1分)、中度(2分)、重度(3分)進(jìn)行評分，總分15分。

1.5 肺組織細(xì)胞細(xì)胞核P65的Western blot檢測 各組大鼠造模24 h后，斷頸處死，開胸留取50 mg肺組織，液氮下研磨后，PBS洗滌2次，核蛋白提取裂解緩沖液，冰上60 min，10 000 r/min離心20 min，PBS洗滌沉淀2次，加入蛋白裂解液提取核蛋白，Bradford法定量蛋白濃度后，取10 μg核蛋白加入SDS-PAGE凝膠樣品孔中，電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入羊抗鼠P65抗體(美國Cell signal公司)孵育過夜后，加入馬抗羊辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(上海康城生物科技技術(shù)有限公司)，化學(xué)發(fā)光顯示目的條帶，掃描條帶后使用Quantity One V 4.3.0軟件測定條帶光密度值，以組蛋白為內(nèi)參計算各樣品的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方差分析，組間相互比較采用LSD檢驗(yàn)，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組術(shù)后存活率比較 假手術(shù)組無大鼠死亡，存活率為100.0%；膿毒癥模型組死亡8只，存活13只，存活率為65.0%；白藜蘆醇干預(yù)組死亡4只，存活16只，存活率為80.0%；3組存活率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中假手術(shù)組存活率顯著高于白藜蘆醇干預(yù)組(P<0.05)，白藜蘆醇干預(yù)組顯著高于膿毒癥模型組(P<0.05)。

2.2 三組肺組織損傷的比較 假手術(shù)組、膿毒癥模型組和白藜蘆醇干預(yù)組肺損傷評分分別為1.84±0.42、11.62±2.26和5.27±1.43，3組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其中假手術(shù)組肺損傷評分顯著低于白藜蘆醇干預(yù)組(P<0.01)，白藜蘆醇干預(yù)組顯著低于膿毒癥模型組(P<0.01)。

2.3 三組大鼠外周血TNF-α、IL-6表達(dá)的比較 假手術(shù)組、膿毒癥模型組和白藜蘆醇干預(yù)組造模前TNF-α和IL-6表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模24 h后，3組TNF-α和IL-6表達(dá)均顯著升高，但假手術(shù)組TNF-α和IL-6表達(dá)顯著低于白藜蘆醇干預(yù)組(P<0.01)，白藜蘆醇干預(yù)組顯著低于膿毒癥模型組(P<0.01)。見表1。

表1 三組SD大鼠造模前后TNF-α和IL-6表達(dá)比較(μg/ml)

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.01；與膿毒癥模型組比較，▲▲P<0.01；與造模前比較，##P<0.01

2.4 三組造模24 h后肺組織細(xì)胞細(xì)胞核P65的表達(dá) 經(jīng)灰度掃描后，假手術(shù)組、膿毒癥模型組和白藜蘆醇干預(yù)組肺組織細(xì)胞核P65相對灰度值分別為0.14±0.02、0.57±0.14、0.32±0.08，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。其中假手術(shù)組肺組織細(xì)胞細(xì)胞核P65表達(dá)顯著低于白藜蘆醇干預(yù)組，白藜蘆醇干預(yù)組顯著低于膿毒癥模型組。見圖1。

圖1 3組SD大鼠造模24 h后肺組織細(xì)胞核P65表達(dá)的Western blot檢測

3 討論

20%的急性肺損傷是由膿毒癥時炎癥介質(zhì)紊亂引起的[6]。TNF-α和IL-6是常見的炎癥因子，這些炎癥介質(zhì)一方面參與到組織損傷中，另一方面又可以激發(fā)下游反應(yīng)，導(dǎo)致炎癥的級聯(lián)效應(yīng)[7]。白藜蘆醇是一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，屬于植物類抗毒素，白藜蘆醇或含白藜蘆醇食物的抗炎作用已被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)所證實(shí)[8]，余應(yīng)喜等[9]研究顯示，白藜蘆醇抑制膿毒癥大鼠巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2、IL-10、IL-18表達(dá)后，可以發(fā)揮對急性肺損傷的保護(hù)作用；周繼紅等[10]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以下調(diào)膿毒癥大鼠肺組織HGMB1和TLR4 mRNA表達(dá)，發(fā)揮對急性肺損傷的保護(hù)作用。本研究也顯示，白藜蘆醇干預(yù)組肺損傷評分顯著低于膿毒癥模型組，說明白藜蘆醇對膿毒癥時肺損傷有保護(hù)作用。

NF-κB信號通路是調(diào)節(jié)TNF-α和IL-6的重要炎性通路，膿毒癥時NF-κB信號通路會被激活[11]。鄒憲寶等[12]研究顯示，膿毒癥血清可以激活人肺血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB信號通路，激發(fā)炎癥反應(yīng)，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。NF-κB信號通路激活時P65蛋白會分離出來，進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，因此，檢測細(xì)胞核中P65的表達(dá)可以反映NF-κB信號通路的激活。本研究結(jié)果表明，假手術(shù)組肺組織細(xì)胞細(xì)胞核P65表達(dá)顯著低于白藜蘆醇干預(yù)組，白藜蘆醇干預(yù)組顯著低于膿毒癥模型組，說明膿毒癥大鼠肺組織細(xì)胞中NF-κB信號通路處于激活狀態(tài)，而且白藜蘆醇對這種激活有抑制作用。邱榮宗等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對膿毒癥大鼠NF-κB通路具有調(diào)節(jié)作用。TNF-α和IL-6炎癥因子檢測結(jié)果表明，白藜蘆醇干預(yù)組TNF-α和IL-6表達(dá)顯著低于膿毒癥模型組，提示白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)NF-κB通路，抑制膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)膿毒癥大鼠的NF-κB通路，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮了對肺損傷的保護(hù)作用。