河南省焦作市中心血站（454000）關(guān)茵 張國(guó)平 王琳 韓惠云 來(lái)祝檁

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）具有高度的靈敏度和特異性，可有效縮短病毒檢測(cè)“窗口期”，減少輸血風(fēng)險(xiǎn)，提高輸血安全性[1]。我站利用該技術(shù)對(duì)所有無(wú)償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本，進(jìn)行乙型肝炎病毒（HBV DNA）、丙型肝炎病毒(HCV RNA)及艾滋病病毒(HIV RNA)核酸檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了無(wú)償獻(xiàn)血者核酸檢測(cè)全覆蓋[2]，取得了良好的應(yīng)用效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2015年1月～2017年12月，經(jīng)過(guò)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、乙肝表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎抗體（抗HCV）、艾滋病病毒抗體（抗HIV）和梅毒抗體（抗TP），初檢復(fù)檢2次檢測(cè)合格的無(wú)償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本242698份。

1.2 試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（上海浩源生物科技有限公司），HBsAg ELISA試劑盒(初檢北京萬(wàn)泰生物技術(shù)有限公司、復(fù)檢法國(guó)BIO-RAD生物技術(shù)有限公司)，抗HCV ELISA試劑盒(初檢珠海麗珠試劑股份有限公司、復(fù)檢北京萬(wàn)泰生物技術(shù)有限公司)，抗HIV ELISA試劑盒(初檢珠海麗珠試劑股份有限公司、復(fù)檢法國(guó)BIO-RAD生物技術(shù)有限公司)，抗TP ELISA試劑盒(初檢珠海麗珠試劑股份有限公司、復(fù)檢北京萬(wàn)泰生物技術(shù)有限公司)，ALT速率法試劑盒（初檢中生北控生物科技股份有限公司、復(fù)檢上海榮盛生物技術(shù)有限公司），質(zhì)控品(北京康徹思坦生物技術(shù)有限公司)。所有試劑均按操作使用說(shuō)明書使用，并在有效期內(nèi)使用。

1.3 主要儀器 ChiTaS BSS1200全自動(dòng)核酸純化儀（上海浩源生物科技有限公司），ABI 7500實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），TDL5B臺(tái)式大容量低溫離心機(jī)（長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司），采血管開蓋機(jī)（珠海倍健電子科技有限公司），BSC-1500ⅡB2-X生物安全柜（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司），AEROSET全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)abbott公司），STAR全自動(dòng)樣本處理系統(tǒng)(瑞士HAMILTON公司)，F(xiàn)AME全自動(dòng)酶免分析系統(tǒng)(瑞士HAMILTON公司)，UranusAE 200全自動(dòng)酶免分析儀(深圳市愛(ài)康電子有限公司)，SUNRISE掃描酶標(biāo)儀(奧地利TECAN公司)，Columbus洗板機(jī)(奧地利TECAN公司)。

1.4 方法

1.4.1 血清學(xué)項(xiàng)目檢測(cè)流程 無(wú)償獻(xiàn)血者血液檢測(cè)項(xiàng)目包括ALT、HBsAg、抗HCV、抗HIV、抗TP，均進(jìn)行初檢、復(fù)檢2次檢測(cè)。如果所有檢測(cè)項(xiàng)目初檢、復(fù)檢均為非反應(yīng)性，則該標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果總評(píng)為合格；有一個(gè)或一個(gè)以上檢測(cè)項(xiàng)目為反應(yīng)性，則該標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果總評(píng)為待檢。待檢標(biāo)本在下一批次檢驗(yàn)時(shí)，對(duì)反應(yīng)性項(xiàng)目采用雙孔復(fù)試，如果雙孔復(fù)試均為非反應(yīng)性，則該標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果總評(píng)為合格；如有一孔或雙孔為反應(yīng)性，則該標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果總評(píng)為不合格，按醫(yī)療廢物相關(guān)規(guī)定執(zhí)行報(bào)廢處置?？傇u(píng)結(jié)果為合格的標(biāo)本，再進(jìn)行核酸檢測(cè)。

附表1 檢測(cè)標(biāo)本結(jié)果判讀規(guī)則

附表2 陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照結(jié)果判定規(guī)則

1.4.2 混樣核酸檢測(cè) 利用ChiTaS全自動(dòng)核酸純化儀，將8人份獻(xiàn)血者標(biāo)本匯集為1個(gè)Pool，每份標(biāo)本取150μl血漿共1.2ml，不足8份標(biāo)本時(shí)，用試劑盒內(nèi)平衡液補(bǔ)足至1.2ml。標(biāo)本匯集后，進(jìn)行核酸提取、反應(yīng)液分配，再置于ABI 7500實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增儀擴(kuò)增檢測(cè)。若1個(gè)Pool的檢測(cè)結(jié)果為非反應(yīng)性，則該P(yáng)ool的8份標(biāo)本均判讀為非反應(yīng)性；若1個(gè)Pool的檢測(cè)結(jié)果為反應(yīng)性，則該P(yáng)ool的8份標(biāo)本再進(jìn)行拆分單檢。

1.4.3 拆分單檢 取混樣檢測(cè)反應(yīng)性標(biāo)本血漿1.2ml，進(jìn)行拆分單檢。若檢測(cè)結(jié)果為某項(xiàng)目反應(yīng)性，則該標(biāo)本按該項(xiàng)目反應(yīng)性報(bào)告；若檢測(cè)結(jié)果為非反應(yīng)性，則該標(biāo)本按非反應(yīng)性報(bào)告。

1.4.4 結(jié)果判讀 核酸檢測(cè)標(biāo)本判讀規(guī)則見(jiàn)附表1。

1.4.5 質(zhì)量控制 以一次完整的核酸檢測(cè)作為一批，每批設(shè)定一個(gè)室內(nèi)質(zhì)控、一個(gè)陰性對(duì)照、一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照、每個(gè)pool內(nèi)都設(shè)內(nèi)對(duì)照，對(duì)照結(jié)果判讀規(guī)則見(jiàn)附表2。每年參加國(guó)家衛(wèi)計(jì)委臨檢中心舉辦的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測(cè)合格的242698份無(wú)償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，HBV DNA反應(yīng)性137例，HCV RNA反應(yīng)性0例，HIV RNA反應(yīng)性0例。

2.2 參加國(guó)家衛(wèi)計(jì)委臨檢中心舉辦的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)，檢測(cè)結(jié)果均正確，綜合得分均為100分。

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種體外模擬自然DNA復(fù)制過(guò)程的技術(shù)，主要由引物、DNA聚合酶、dNTP（三磷酸脫氧核糖核苷）、模板和鎂離子等基本要素組成。通過(guò)加熱變性、退火、延伸3個(gè)反應(yīng)步驟的不斷循環(huán)，完成DNA的擴(kuò)增放大。在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，可對(duì)待測(cè)標(biāo)本中的起始模板進(jìn)行定量分析[3]。

目前為避免經(jīng)血液途徑傳播HBV、HCV、HIV，按照國(guó)家規(guī)定對(duì)獻(xiàn)血者進(jìn)行HBsAg、抗HCV、抗HIV篩查[4]，但現(xiàn)有的檢測(cè)方法存在"窗口期"較長(zhǎng)的問(wèn)題[5]。而核酸檢測(cè)平均可將HBV、HCV、HIV檢測(cè)“窗口期”由原來(lái)的56天、82天、22天，縮短至33天、22天、11天，分別縮短40%、73%和50%[6]。此外，核酸技術(shù)還能檢出現(xiàn)有的免疫學(xué)方法尚不能檢出的免疫靜默感染、乙肝隱匿性感染、病毒變異株感染等[7]，可進(jìn)一步保障用血安全。

歐美等許多國(guó)家和地區(qū)早在20世紀(jì)90年代末已將核酸檢測(cè)作為常規(guī)技術(shù)納入獻(xiàn)血者血液篩查[8]，我國(guó)于2010年開始進(jìn)行獻(xiàn)血者核酸檢測(cè)試點(diǎn)工作[9]。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)242698份無(wú)償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本，共發(fā)現(xiàn)酶免非反應(yīng)性而核酸單檢HBV DNA反應(yīng)性137例，反應(yīng)性率0.057%，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[10]。

通過(guò)開展獻(xiàn)血者核酸檢測(cè)工作，進(jìn)一步提高了血站實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力，可有效縮短病毒檢測(cè)的窗口期[11][12]，為臨床提供更加安全有效的血液和血液制品，進(jìn)一步提高血液安全水平。