聞子鈺,顧一心,梁 昊,王佳奇,鞠長(zhǎng)燕,馬艷萍,張茂俊,段永翔

空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)是最常見(jiàn)的食源性病原菌之一,與沙門氏菌、志賀氏菌并列為人類三大腹瀉致病菌。該菌屬于彎曲菌屬,為微需氧菌,在大氣或厭氧的環(huán)境中均不生長(zhǎng),廣泛存在于家禽腸道中[1],并通過(guò)污染肉品、食物或水源導(dǎo)致人類感染,主要引起人的發(fā)熱和急性腸胃炎,進(jìn)一步還可引發(fā)心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎等全身性疾病[2],研究表明,特定血清型的空腸彎曲菌感染與吉蘭-巴雷綜合征的發(fā)病密切相關(guān)[3-5]。

目前對(duì)于彎曲菌的檢測(cè)方法是傳統(tǒng)的培養(yǎng)法,從富集培養(yǎng)、選擇性分離、形態(tài)特征觀察、生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定等過(guò)程,時(shí)間長(zhǎng)達(dá)5～7 d左右,操作過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力,影響因素較多,靈敏度偏低[6]。熒光定量PCR技術(shù)能夠快速定量檢測(cè)樣本中病原菌的污染,但其通過(guò)檢測(cè)樣品中特異核酸的存在及拷貝數(shù),對(duì)樣本中“死菌”的擴(kuò)增導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果,不能真正反映樣品中活菌的數(shù)量。

疊氮溴化乙錠(Ethidium monoazide,EMA)是溴化乙錠的衍生物,能夠進(jìn)入受到損害的細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,隨后共價(jià)結(jié)合在其DNA上,不能被PCR所擴(kuò)增?；罹?xì)胞因具有完整的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,使其得到保護(hù)不受EMA共價(jià)反應(yīng)的影響,因此,利用EMA預(yù)處理模板可克服PCR檢測(cè)的假陽(yáng)性結(jié)果。本研究通過(guò)優(yōu)化EMA使用濃度,建立EMA-qPCR組合檢測(cè)技術(shù),并進(jìn)行模擬食品標(biāo)本的驗(yàn)證,從而建立一種快速定量檢測(cè)“活的”空腸彎曲菌的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 空腸彎曲菌為中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病所保存。

1.1.2 試劑和儀器 疊氮溴化乙錠EMA(Biotium,美國(guó)),裂解液(由本實(shí)驗(yàn)室配制),QIAamp DNA mini kit(德 國(guó) QIAGEN)、QIAamp DNA Stool Mini Kit(德國(guó)QIAGEN)、彎曲菌培養(yǎng)檢測(cè)試劑盒(青島中創(chuàng)生物科技有限公司),TranStartProbe qPCR Super Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司);振蕩恒溫金屬浴(MB-102,杭州博日科技有限公司)、17R離心機(jī)(Thermo)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、活菌甄選儀BluCoo(北京博瑞立安生物技術(shù)有限公司BBI)。

1.1.3 引物和探針 針對(duì)彎曲菌擴(kuò)增的探針引物參考文獻(xiàn)[7],序列見(jiàn)下:

1.2 方 法

1.2.1 優(yōu)化EMA使用濃度

1.2.1.1 空腸彎曲活菌、死菌的制備 空腸彎曲菌接種于加脫纖維羊血Karmali培養(yǎng)基上,置于三氣培養(yǎng)箱(5%O2,10%CO2,85%N2)中37℃生長(zhǎng)48 h,使用1 L接種環(huán)刮取一環(huán)空腸彎曲菌溶于1 mL 0.85%預(yù)冷的生理鹽水中,紫外分光光度計(jì)調(diào)節(jié)菌液濃度A600＝1(109CFU/mL),用生理鹽水10倍梯度稀釋至106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL,各濃度取1/2體積作為活菌,取1/2體積于水浴鍋加熱(95℃,10 min)作為死菌,并于培養(yǎng)基驗(yàn)證完全處死。

1.2.1.2 EMA 處理 將106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL的活、死菌懸液分別分裝200μL至1.5 mL EP管中,加入不同體積的1 mg/mL EMA 至終濃度為0(對(duì)照組)、2、5、10、20、50μg/mL,并進(jìn)行標(biāo)記,重復(fù)1次操作作為平行對(duì)照,以上步驟均在冰上操作。充分混勻后置于活菌甄選儀中,4℃,暗反應(yīng)5 min,光反應(yīng)15 min。

1.2.1.3 DNA提取 取出活菌甄選儀中的樣品,離心(4℃,12 000 g,10 min)后,重懸于裂解液中,金屬浴加熱(100℃,10 min),離心(4℃,16 000 g,5 min),DNA于-20℃保存。

1.2.1.4 熒光定量PCR 反應(yīng)條件:總體系20μL,成分 如 下:TranStart○RProbe qPCR Super Mix 10 μL,Nuclease-free Water 5.5μL,上游及下游引物0.3μmol/L,探針0.15μmol/L,DNA 3μL。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min,45個(gè)循環(huán)中94℃變性15 s,60℃退火及延伸1 min,退火階段采集熒光信號(hào)。

1.2.2 EMA-qPCR檢測(cè)空腸彎曲菌的死/活混合物按1.2.1.1所述步驟制備106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL的死、活空腸彎曲菌,每個(gè)濃度均進(jìn)行以下操作:以活菌比例占0%(800μL D),10%(80μL V＋720μL D),30%(240μL V＋560μL D),50%(400μL V＋400μL D),70%(560μL V＋240μL D),90%(720μL V＋80μL D),100%(800 μL D)與同濃度的死菌混合(V:活菌,D:死菌),充分混勻后分裝200μL至EP管中,每個(gè)比例的兩管作為處理組,兩管作為對(duì)照組1,同時(shí)活菌按相同比例與生理鹽水混合作為對(duì)照組2,設(shè)一個(gè)平行對(duì)照,以上操作在冰上進(jìn)行。處理組加入1 mg/mL EMA至終濃度為5μg/mL,對(duì)照組不加EMA,充分混勻后置于預(yù)冷4℃的活菌甄選儀中,暗反應(yīng)進(jìn)行5 min,光反應(yīng)進(jìn)行15 min,按1.2.1.3、1.2.1.4步驟提取DNA及進(jìn)行熒光定量PCR。

1.2.3 EMA-qPCR檢測(cè)模擬食品標(biāo)本

1.2.3.1 食品盥洗液制備 于超市購(gòu)買3只雞腿肉各75 g,分別放入無(wú)菌袋中,加入100 mL 0.1% 滅菌蛋白胨水盥洗15 min,盥洗液分裝至2個(gè)50 mL離心管中,4℃保存。

1.2.3.2 本底檢測(cè) 取1管50 mL盥洗液,將試劑盒中的雙孔板從4℃冷藏室拿出后,室溫平衡后(約30 min),使用無(wú)菌鑷子將濾膜輕輕貼在雙孔板的中間上,吸取300μL混勻后的增菌培養(yǎng)液分6～7個(gè)點(diǎn)均勻滴加雙孔板的濾膜上,待水分充分透過(guò)濾膜(約1 h),使用無(wú)菌鑷子輕輕的揭去濾膜,翻轉(zhuǎn)平板。置于微需氧環(huán)境37℃培養(yǎng)48 h。離心管內(nèi)剩余溶液離心(4℃,4 000 r/min,10 min,離心半徑為9 cm),棄上清,按照QIAamp DNA Stool Mini Kit步驟說(shuō)明提取DNA,應(yīng)用檢測(cè)彎曲菌的熒光定量PCR驗(yàn)證是否含有彎曲菌。

1.2.3.3 模擬感染空腸彎曲菌 按1.2.1.1所述步驟制備107CFU/mL、106CFU/mL濃度活、死狀態(tài)的空腸彎曲菌,各濃度分別以活菌占10%(2μL V＋18μL D)的比例與同菌種同濃度的死菌混合作為處理組和對(duì)照組1,同時(shí)與生理鹽水混合作為對(duì)照組2,于含有死/活菌混合液的EP管中分別加入180μL的3份驗(yàn)證無(wú)彎曲菌存在的雞肉盥洗液(此時(shí)空彎活菌濃度為105CFU/mL、104CFU/mL)。處理組加入EMA至終濃度為5 g/mL,對(duì)照組不加EMA,所有步驟在冰上操作。處理組充分混勻后置于活菌甄選儀中,4℃,暗反應(yīng)5 min,光反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后使用Qiagen mini kit試劑盒提取DNA,應(yīng)用擴(kuò)增彎曲菌的熒光定量PCR檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,采用Dunnett-t檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 EMA最優(yōu)濃度 將106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL死、活菌分別使用EMA作用后,熒光定量PCR結(jié)果如下(見(jiàn)表1),EMA終濃度為5～10μg/mL時(shí),死菌在106、105、104、103時(shí),死菌的Ct值比不加EMA的Ct明顯提高6個(gè)單位左右,EMA終濃度為10μg/mL時(shí),活菌在105CFU/mL時(shí),Ct值約增加1個(gè)單位,EMA終濃度小于5μg/mL時(shí),對(duì)活菌Ct值無(wú)影響。綜合各濃度考慮,5μg/mL為EMA應(yīng)用于“活的”空腸彎曲菌檢測(cè)前處理的最優(yōu)濃度。

表1 EMA作用濃度的優(yōu)化結(jié)果Tab.1 Optimization of EMA concentration

2.2 EMA-qPCR檢測(cè)空腸彎曲菌死/活混合物對(duì)不同濃度的以不同活菌、死菌比例混合后的死/活混合物進(jìn)行終濃度為5μg/mL的EMA處理,熒光定量PCR結(jié)果如下(見(jiàn)圖1,圖2,圖3):菌總量在106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL時(shí),活、死菌混合物進(jìn)行EMA處理后與活菌與生理鹽水混合物的對(duì)照組2的Ct值在活菌比例占10%、20%、50%、70%、90%、100%時(shí)基本一致,活、死菌混合物進(jìn)行EMA處理后與活、死菌混合物的不加EMA處理對(duì)照組1的Ct值在活菌比例小于70%時(shí)有差距,并隨著活菌比例趨于100%而趨于一致。表明EMA-qPCR可從純培養(yǎng)的空腸彎曲菌的死/活混合物中識(shí)別出“活的”空腸彎曲菌。

圖1 空腸彎曲菌的不同活菌比例的EMA-qPCR(106)Fig.1 EMA-qPCR results of different ratios of viable C.jejuni cells(106)

圖2 空腸彎曲菌的不同活菌比例的EMA-qPCR(105)Fig.2 EMA-qPCR results of different ratios of viable C.jejuni cells(105)

圖3 空腸彎曲菌的不同活菌比例的EMA-qPCR(104)Fig.3 EMA-qPCR results of different ratios of viable C.jejuni cells(104)

2.3 EMA-qPCR檢測(cè)模擬食品標(biāo)本 對(duì)人工感染空腸彎曲菌的模擬食品進(jìn)行終濃度為5μg/mL的EMA結(jié)合qPCR,經(jīng)SPSS24.0單因素方差分析及LSD多重比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)＝0.05。結(jié)果如表2,菌濃度為106CFU/mL,活菌占10%時(shí),3組Ct值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝49.404,P＝0.001＜0.05),處理組與對(duì)照組1的Ct值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝9.378,P＜0.001);處理組與對(duì)照組2的Ct值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝1.834,P＝0.116);菌濃度為105CFU/mL,活菌占10%時(shí),3組Ct值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝26.190,P＝0.001＜0.05),處理組與對(duì)照組1的Ct值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝6.756,P＝0.001),處理組與對(duì)照組2的Ct值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝1.129,P＝0.302)。表明EMA-qPCR可成功識(shí)別模擬食品中“活的”空腸彎曲菌。

表2 模擬食品感染空腸彎曲活、死菌混合物的EMA-qPCR結(jié)果Tab.2 EMA-qPCR results of simulated food infection of viable and dead C.jejuni

3 討 論

針對(duì)特異基因序列設(shè)計(jì)引物或探針的PCR技術(shù),以DNA為靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增,無(wú)法避免死菌DNA產(chǎn)生擴(kuò)增信號(hào)的影響。僅識(shí)別活菌的擴(kuò)增信號(hào)對(duì)于分子生物學(xué)技術(shù)在食品檢測(cè)及監(jiān)測(cè)的應(yīng)用更有意義,同時(shí)減輕了大量的經(jīng)濟(jì)損失?；趍RNA及基于膜通透性的活性染料法是目前實(shí)現(xiàn)PCR進(jìn)行活菌檢測(cè)的2種方法。mRNA半衰期較短,在細(xì)菌死亡后很快降解,因此對(duì)mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR可達(dá)到只檢測(cè)活菌的目的,但存在一系列困難,首先,食品中存在的脂肪等抑制劑導(dǎo)致RNA提取較為困難[8];其次,RNA在細(xì)菌中含量較少,易被內(nèi)源性外源性RNA酶降解,受實(shí)驗(yàn)操作者影響較大;再次,RT-qPCR靈敏性較低[8],檢測(cè)過(guò)程需要結(jié)合增菌步驟,增加了檢測(cè)時(shí)間,當(dāng)死菌含量較大時(shí),RNA并不能完全降解,導(dǎo)致產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[9]。

EMA是一種可以進(jìn)入死菌受損的細(xì)胞膜并結(jié)合DNA形成共價(jià)化合物的活性染料,對(duì)樣本進(jìn)行前處理后,可避免PCR對(duì)死菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)生的假陽(yáng)性結(jié)果[10]。但成功地應(yīng)用EMA,必須考慮可能會(huì)影響結(jié)果數(shù)據(jù)的多因素,包括染料的濃度、孵育時(shí)間;光源及曝光時(shí)間、光照距離;是否存在大量死亡細(xì)胞,待檢樣品中存在高水平的懸浮固體或生物量;反應(yīng)混合液中的鹽濃度、p H;目標(biāo)基因的長(zhǎng)度、序列等[9]。以往研究大多采用鹵素?zé)糇鳛楣庠?鹵素?zé)羰且环N產(chǎn)熱光源,其產(chǎn)生的熱能可能對(duì)活細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用,研究者通過(guò)控制光源距離及冰上操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn),由于研究條件不同,研究結(jié)果通常呈現(xiàn)多樣性。本研究采用了活菌甄選儀,其冷光源對(duì)活細(xì)胞無(wú)損傷,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度也是一個(gè)重要影響因素,可能是由于細(xì)菌周圍環(huán)境的升高使得細(xì)菌細(xì)胞膜處于不穩(wěn)定狀態(tài),因此在EMA使用的過(guò)程中需在在冰上操作,保持活菌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。

本研究以建立“活的”空腸彎曲菌的檢測(cè)技術(shù)為目的,結(jié)果表明空腸彎曲菌的最優(yōu)EMA終濃度為5～10μg/mL,EMA的使用濃度并未隨空腸彎曲菌濃度的不同發(fā)生較大改變,綜合濃度及經(jīng)濟(jì)考慮,將5μg/mL應(yīng)用于純培養(yǎng)的死/活菌混合物及模擬食品檢測(cè)后,EMA-qPCR技術(shù)成功區(qū)分活、死菌?；罹壤笥?%或10%時(shí),處理組與對(duì)照組2即保持一致,表明可區(qū)分死、活菌。在對(duì)加入EMA處理后的樣品進(jìn)行菌落培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)EMA處理后的活菌樣品無(wú)菌落生長(zhǎng),可能是EMA對(duì)活細(xì)胞具有毒性作用,無(wú)法培養(yǎng),但進(jìn)行熒光PCR可檢測(cè)出Ct值,與未進(jìn)行EMA處理的活菌樣品相比無(wú)差異,不影響EMA區(qū)別死、活菌的效果。研究表明,在實(shí)際標(biāo)本的基質(zhì)中除空腸彎曲菌之外的其他菌群不會(huì)影響EMA的作用[11]。相比之下,RT-qPCR共消耗7美元[12],EMA-qPCR處理1份樣品需比qPCR成本增加0.4元,EMA更為經(jīng)濟(jì),且無(wú)需增菌步驟,本研究建立的EMA-qPCR活菌檢測(cè)技術(shù)可用于“活的”空腸彎曲菌的檢測(cè)。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:聞子鈺,顧一心,梁昊,等.EMA-qPCR檢測(cè)空腸彎曲活菌方法研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2019,35(9):821-825.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.117