湯 麗,邵宗體,段興德,江佳富,賈 娜,張 云,何志海,李玉瓊,劉正祥,浦恩念,陳 星,劉洪波,蔣寶貴,高子厚,杜春紅

無形體又稱無漿體(Anaplasma),為革蘭氏陰性、專性細胞內(nèi)寄生菌,依據(jù)2004年《伯杰氏細菌鑒定手冊》(第9版),無形體與人埃立克體均歸類為變形菌綱(Alphaproteobacteria)、立克次氏體目(Rickettsiaies),無形體科(Anoplasmataceae),無形體屬(Anaplasma)。其成員繁多,主要包括嗜吞噬細胞無形體(A.phagocytophilum)、綿羊無形體(A.ovis)、邊緣無形體(A.marginale)、血小板無形體(A.platys)、牛無形體(A.bovis)、中央無形體(A.centrale)和山羊無形體(A.capra)7種[1-2]。主要侵染人與動物的血細胞(粒細胞、單核細胞、紅細胞和血小板),并以包涵體的形式在宿主動物胞漿中繁殖,導致人和動物的無形體病。其中A.phagocytophilum、A.capra和A.ovis變異種可對人類致病。人類、野生大型哺乳動物、家畜以及小型獸類是無形體的病原攜帶者和重要傳染源[3],病原體通過傳播媒介蜱叮咬或破損皮膚黏膜接觸含病原體的血液、體液進行傳播。

云南省地形及氣候復雜多樣,動物及植被種類豐富,被譽為“動植物王國”,其特有的地理特征和氣候條件使該地區(qū)宿主動物和媒介昆蟲種類多,分布廣,是各種蟲媒傳染病的高發(fā)地區(qū)。既往資料顯示,在云南曲靖市、德宏州以及橫斷山區(qū)的小型獸類和犬中存在無形體感染,但是還缺乏系統(tǒng)的流行病學資料[4-5]。為了解云南省小型獸類無形體的感染狀況,本研究進行了分子生物學調(diào)查,結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 標本采集 2011年5月—2016年11月,在云南省22個縣(市),按照不同海拔梯度和不同氣候帶類型、不同生境(居民區(qū)、林區(qū)和農(nóng)耕區(qū))共130個采樣點,居民區(qū)采用籠日法,林區(qū)與農(nóng)耕區(qū)采用夾線法捕獲2 251只小型獸類。在現(xiàn)場實驗室按形態(tài)特征對小型獸類進行種類鑒定,以是否性成熟(雄性睪丸下降明顯,雌性陰道已開口)為劃分成年與未成年小型獸類的標準。解剖采集臟器樣本,液氮保存帶回實驗室進行檢測。采集地分布見圖1。

圖1 調(diào)查采樣區(qū)及檢測結(jié)果分布圖Fig.1 Distribution of sampling area and result of test

1.2 試劑與設(shè)備 血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN Genomic DNA Kit,lot:DP304),Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)(Thermo Fisher Scientific),DL2000 DNA Marker(Takara),PCR儀(SENSO,LabCycler Gradient Fuses型),水平電泳槽(JY-SPFT型)、高通量組織研磨儀(Retsch MM400)和凝膠成像儀(Syngene)。

1.3 方 法

1.3.1 DNA提取 取小型獸類脾組織約10 mg,以高通量組織研磨儀設(shè)定參數(shù)為20次/s,1 min,研磨為細胞懸液,按照試劑盒說明書的操作步驟對樣本進行DNA提取。

1.3.2 PCR擴增 采用半巢式PCR擴增無形體16S rRNA基因前半巢660 bp片段。引物:Eh-out1(5′-TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG-3′)、3-17 pan(5′-TAAGGTGGTAATCCAGC-3′)和 Eh-out2(5′-CACCTCTACACTAGGAATTCCGCTATC-3′)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

反應(yīng)條件:采用半巢式PCR,第1輪:即95℃預變性3 min,95℃變性30 s,50℃退火30s,和72℃延伸1 min 30 s,最后72℃終延伸7 min。第2輪:即95℃預變性3 min,95℃變性30 s。52℃退火30 s,72℃延伸1 min,最后72℃終延伸7 min。均為35個循環(huán)。預期片段大小為660 bp。

1.3.3 序列測定與分析 測序后登錄(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行 BLAST 比對,利用MEGA6.06構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹并分析。進化歷史推斷采用Neighbor-Joining方法,進化距離采用p-distance,Bootstrap試驗重復1 000次。

1.3.4 統(tǒng)計學分析 運用SPSS19.0軟件對其進行統(tǒng)計學分析,采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗,分析了解小型獸類的陽性率與海拔、性別、年齡和生境之間的關(guān)系。并采用logistic回歸分析,探討感染與相關(guān)危險因素的關(guān)系,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同地區(qū)不同小型獸類感染無形體情況及其與生境、性別、年齡的關(guān)系 分屬4目9科26屬52種的小型獸類2 251份樣本中,共有27份擴增到約660 bp的目的片段?？傟栃月蕿?.20%。陽性樣本分別屬于針尾鼴50.00%(1/2)、紋背鼩鼱12.50%(2/16)、珀氏長吻松鼠8.33%(1/12)、藏鼠兔5.66%(3/53)、白尾松田鼠5.41%(2/37)、西南絨鼠4.00%(2/50)、社鼠3.74%(4/107)、大足鼠3.57%(1/28)、斯氏家鼠2.20%(2/91)、大耳姬鼠1.85%(2/108)、中華姬鼠1.30%(4/308)和黃胸鼠0.69%(3/433),分屬3目6科7屬12種(見表1)。分布在德欽縣、騰沖市、盈江縣、勐臘縣和石屏等5個縣(市)的18個采樣點,見圖1、表2。從圖1中可以看出,陽性樣本主要分布于滇西北橫斷山脈一帶。根據(jù)樣本信息進行統(tǒng)計學分析,陽性小型獸類在林區(qū)、農(nóng)耕區(qū)和居民區(qū)的陽性率分別為1.49%,0.99%和0%,差異無統(tǒng)計學意義(P＝0.290)。雄性小型獸類的陽性率(1.75%)高于雌性(0.68%)(P＝0.02),見表3。成年小型獸類與未成年小型獸類之間的陽性率無統(tǒng)計學差異(P＝0.291),見表4。在海拔＜1 500 m、1 500～2 500 m、＞2 500 m的小型獸類中,陽性率分別是0.22%,0.09%和0.89%,差異有統(tǒng)計學意義(P＝0.037)。logistic回歸分析顯示,1 500～2 500 m采樣和雄性小型獸類是無形體感染的危險因素,見表5。不同調(diào)查點小型獸類無形體檢測結(jié)果見表6。

表1 不同小型獸類攜帶無形體的檢測結(jié)果Tab.1 Results of Anaplasma in small mammals of different species

表1 (續(xù))

表2 不同景觀小型獸類無形體的攜帶情況Tab.2 Results of Anaplasma in small mammals in different landscapes

表3 不同性別小型獸類無形體的攜帶情況Tab.3 Results of Anaplasma in small mammals in different gender

表4 不同年齡小型獸類無形體的感染情況Tab．4 Results of Anaplasma in small mammals from different ages

表5 不同海拔捕獲小型獸類無形體的感染情況Tab.5 Results of Anaplasma in small mammals in different altitude

2.2 PCR擴增陽性產(chǎn)物序列分析 對陽性樣本16S rRNA基因660 bp序列進行分析,結(jié)果顯示變異較大,他們之間的核苷酸同源性為99%～100%。與目前已知的A.phagocytophilum比較,其核苷酸同源性為97%～100%?；跓o形體16S rRNA基因660 bp序列,選取代表序列以Rickettsia rickettsii為外參照建立系統(tǒng)發(fā)育樹進行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果表明云南省小型獸類存在無形體感染,可以分為2群(圖2)。其中,德欽的大部分和騰沖、盈江、勐臘、石屏的全部無形體序列均聚在一個分支。與A.phagocytophilumDog2株(CP006618)、HZ株(CP000235)、Webster株 (NR 044762)、河南株(KC470064)、美國株(KP276588)、捷克株(EU839851)、韓國株(MF351965)和挪威株(CP015376)位于同一大分支,同源性為97%～100%,其中DQ-607與Dog2株(CP006618)、HZ株(CP000235)、Webster株(NR 044762)同源性達97%,DQ-157與 Dog2株(CP006618)、HZ株(CP000235)同源性達100%;Dog2株來自犬,HZ株來源于HL-60細胞培養(yǎng)。而來自德欽的DQ-113等4份樣本處在另一個分枝,與馬拉西亞株(KU189193)位于同一分支,同源性為98%,與來自我國河南信陽長角血蜱中檢測到的無形體(KY007152)有共同的祖先。是否屬于新的無形體值得進一步關(guān)注。

表6 不同調(diào)查點小型獸類無形體檢測結(jié)果Tab.6 Results of Anaplasma infecting small mammals in different sample locations

圖2 A.phagocytophilum基于16S rRNA基因660 bp片段構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree based on16S rRNA gene sequences of 660 bp

3 討 論

A.phagocytophilum主要侵染宿主中性粒細胞,人類主要癥狀是高熱,還有頭痛、疲勞、肌痛等癥狀,對于有基礎(chǔ)性疾病的患者,可導致多器官受累發(fā)生衰竭而死亡,是一種新發(fā)的人獸共患自然疫源性疾病[6]。人類、野生大型哺乳動物、家畜以及小型獸類是無形體的病原攜帶者和重要傳染源[7-8]。動物宿主持續(xù)感染是維持病原體自然循環(huán)的基本條件。既往報道嚙齒動物主要感染A.phagocytophilum,對于其他無形體感染報道較少。2017年10月陸群英等[9]首次報道了社鼠、黃毛鼠和青毛鼠中存在A.bovis感染。本次調(diào)查從云南省22個縣(市)的3目6科7屬12種的2 251只小型獸類中僅檢到27份A.phagocytophilum,總陽性率1.20%(27/2 251),陽性小獸分屬3目6科7屬12種,證實云南省多種小型獸類中存在攜帶A.phagocytophilum的情況。

從近年研究來看,A.phagocytophilum最大的宿主類群是嚙齒動物,家鼠和野鼠中均可檢測到,其中小家鼠、褐家鼠以及白足鼠的報道居多,此外也從食蟲目的部分小型獸類中檢測到。在國內(nèi)其他省份的大、小林姬鼠、黑線姬鼠、小花鼠、棕背、褐家鼠、社鼠、小黃腹鼠、白腹巨鼠、黃毛鼠和沙鼠等中檢測到A.phagocytophilum[10-14]。在云南省的中華姬鼠、齊氏姬鼠、大耳姬鼠、克欽絨鼠、滇絨鼠、西南絨鼠、灰腹鼠、白腹鼠、大足鼠、多齒朐鼴、斯氏花松鼠存在無形體的自然感染[16]。本次調(diào)查檢出A.phagocytophilum的共有12個鼠種,其中針尾鼴、紋背鼩鼱、藏鼠兔、白尾松田鼠和斯氏家鼠未見相關(guān)報道?？赡芘c本次調(diào)查采樣主要以橫斷山區(qū)周邊的22個縣(市)為主,海拔跨度較大(530～4 458 m),此區(qū)域氣候類型多樣,動、植物資源豐富,具有較強的生物多樣性特征有關(guān)。檢出陽性的樣本主要來自滇西北地區(qū)的白芒雪山保護區(qū),捕獲的小型獸類種類較多,檢測出A.phagocytophilum的陽性小型獸類種類也較多。

統(tǒng)計學分析表明,雄性小型獸類無形體的陽性率高于雌性小型獸類的陽性率,可能與雄性小型獸類活動范圍更廣,與蜱接觸機會更多有關(guān)。按海拔高度分析,1 500～2 500 m處捕獲的小型獸類的陽性率最高,檢出的27份陽性樣本,有20份來自此海拔高度。此區(qū)域分布的蜱種如何,攜帶A.phagocytophilum的情況不甚清楚。按地區(qū)分析,主要分布在德欽縣、騰沖市、盈江縣、勐臘縣和石屏縣,有較明顯的地區(qū)分布。并且本項目組的另外一項研究表明,騰沖市和德欽縣的家畜和犬血中也檢測到A.phagocytophilum,因此推測兩地可能是該疾病的潛在疫源地。提醒在滇西北2 500 m以上高海拔地區(qū)進入林區(qū)工作和活動的人員,需注意加強防護,避免遭到蜱的叮咬。

16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也表明,檢出的A.phagocytophilum具有多樣性特征。16S rRNA基因常被用以細菌鑒定或種屬分類,16S rRNA基因序列的相似性至少達到99%才能確定一個種,至少達到95%才能確定一個屬[10]。德欽DQ-113等4份樣本與A.phagocytophilum的16S rRNA基因序列同源性為96%,與無形體未定種的16S rRNA基因序列同源性為98%,推測可能為無形體的新種或亞種,還需進一步調(diào)查確認。

本研究應(yīng)用分子生物學的方法,證實云南省部分縣(市)的小型獸類存在嗜吞噬細胞無形體感染,且宿主動物種類豐富,對當?shù)厝巳旱慕】禈?gòu)成威脅。而人群和媒介蜱、其它宿主的感染和分布以及病原體特征均值得進一步加強研究。

(致謝:現(xiàn)場樣本采集得到當?shù)丶膊☆A防控制中心的大力支持,在此一并致謝!)

利益沖突:無

引用本文格式:湯麗,邵宗體,段興德,等.云南省小型獸類感染無形體的分子流行病學調(diào)查[J].中國人獸共患病學報,2019,35(9):857-864.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.088