江朝源,李 飛,曾喻兵,彭珂楠,張儒博,杜佩珊,馮 宇,殷鑫歡,朱 玲,2,徐志文,2

蓋塔病毒(Getah virus)是披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)成員[1]。1955年Scherer等[2]首次在馬來西亞橡膠林中生存的白雪庫蚊(Culex gelidus)中分離得到該病毒,GETV可感染多種動(dòng)物并引起馬和豬發(fā)病,其癥狀表現(xiàn)為發(fā)燒、蕁麻樣皮疹和后肢水腫[1],2017年10月周峰等[3]首次報(bào)道中國河南省某豬場感染蓋塔病毒。該病毒粒子呈球形,有囊膜及纖突,直徑約70 nm,單股正鏈RNA,病毒基因組全長約11～12 kp,編碼區(qū)包含2個(gè)獨(dú)立開放閱讀框ORF1和ORF2;ORF1長約7 407 bp,編碼4種非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1、NSP2、NSP3和NSP4;ORF2長約3 759 bp,編碼5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白Cap、E3、E2、6K和E1。5′端含有非編碼區(qū)(5′UTR)和帽子結(jié)構(gòu),3′端含有非編碼區(qū)(3′UTR)和Poly(A)尾[3]。由于衣殼蛋白Cap基因全長804 bp,該基因高度保守、對病毒顆粒的形成和存活至關(guān)重要[4];NSP3基因全長約1 572 bp,變異頻繁[5],其C端參與病毒的復(fù)制[6],因此這2個(gè)基因常被分別用作該病毒的檢測、鑒定和變異分析。

本研究首次從中國四川省一豬場混合感染豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),臨床癥狀表現(xiàn)為震顫、皮膚發(fā)紅、精神頹廢、棕黃色腹瀉、關(guān)節(jié)炎的仔豬血液中檢測并分離到1株GETV,對該病毒進(jìn)行全基因序列測定,分析該病毒分子生物學(xué)遺傳特征,對豬源GETV的感染譜和致病性、感染和傳播機(jī)制、環(huán)境微生物學(xué)及公共衛(wèi)生等相關(guān)研究具有重要意義,并為之提供寶貴的研究素材。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料及細(xì)胞系 病料來源于四川省某發(fā)病豬場送檢的發(fā)病仔豬血液,BHK21細(xì)胞、PK-15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要設(shè)備和試劑 RNAiso Plus來自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;DL2000 DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、2×TaqPCR Master-Mix、Nuceanse-Free water和p MD19-Tsimple載體,來自大連寶生物工程有限公司;Trizol LSReagent、小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒和小量膠回收試劑盒,于北京博邁德生物技術(shù)有限公司購買。大腸桿菌DH5α由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心制備,DMEM為Gibco公司產(chǎn)品、胎牛血清為北京四季青公司產(chǎn)品。PCR儀、Gel DocTMEZ imager凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司,恒溫水浴鍋、恒溫?fù)u床購自Thermo Fisher公司;甲基纖維素、福爾馬林和結(jié)晶紫來自成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.1.3 檢測引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank上GETV M1株全基因[7](登錄號為:EU015061),生物工程(上海)公司利用Primer Premiers 5.0軟件針對Cap和NSP3部分序列設(shè)計(jì)2對特異性引物,見表1。

表1 擴(kuò)增GETV Cap和NSP3基因部分序列的引物信息Tab.1 Primers for amplification of some sequences of Cap and NSP3 genes of GETV

1.2 方 法

1.2.1 病料樣品處理 取感染仔豬血樣1 mL,用含青、鏈霉素的DMEM作3∶1(V/W)稀釋。反復(fù)凍融3次后,3 000 r/min離心10 min,取上清保存到-80℃。

1.2.2 病毒分離鑒定 上清液經(jīng)0.22μm濾器除菌,取0.2 mL接種到生長狀況良好的單層BHK21細(xì)胞上。37°C吸附1 h,棄上清,加入2 mL含2%FBS的DMEM維持液,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。每天觀察記錄細(xì)胞病變(CPE),若有病變收取病毒培養(yǎng)物,于-80℃反復(fù)凍融3次,離心取上清接種BHK21細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。盲傳3代后進(jìn)行蝕斑純化和RT-PCR檢測。將純化后有CPE且RT-PCR檢測為GETV陽性的培養(yǎng)物用BHK21細(xì)胞、PK15細(xì)胞傳代5次,收獲病毒置-70℃保存;無CPE者丟棄。

將BHK21細(xì)胞(約106個(gè)/mL)接入96孔板長成單層后,棄去培養(yǎng)基,用無菌PBS沖洗3次。將第5代細(xì)胞培養(yǎng)物10倍系列稀釋,各選取10-3～10-8共6個(gè)稀釋度,以每孔100μL接種BHK21細(xì)胞,每個(gè)稀釋度8個(gè)重復(fù),同時(shí)設(shè)置陰性和陽性對照。37℃、5%CO2吸附1 h后,每孔補(bǔ)加100μL含2%FBS的DMEM維持液,觀察并記錄出現(xiàn)CPE孔數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次,運(yùn)用Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.2.3 GETV核酸檢測 取300μL病毒液按照TrizolRNA提取試劑盒說明書提取病毒總RNA。反轉(zhuǎn)錄體系(10μL):dd H2O 4.5μL、5×Buffer 2.0 μL、反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL、d NTP 0.5μL、隨機(jī)引物0.5 μL、模板2.0μL。反應(yīng)條件為:35℃5 s、85℃15 min,cDNA模板用于PCR擴(kuò)增。PCR體系(10 μL):2×TaqPCRmaster Mix 5.0μL、cDNA 1.0 μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、dd H2O 3.0 μL。反應(yīng)擴(kuò)增條件:Cap基因95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán),72℃延伸7 min;NSP3基因95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,56℃退火35 s,72℃延伸40 s,共35個(gè)循環(huán),72℃延伸7 min擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行凝膠成像觀察。

1.2.4 GETV全基因擴(kuò)增與測序 全基因組序列參考HNNY-2株設(shè)計(jì)12對引物分段進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增的目的片段按DNA膠回收試劑盒說明書回收純化產(chǎn)物,與p MD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化、篩選及PCR鑒定后,送至生工生物工程(上海)公司測序,12對引物序列見表2。

表2 擴(kuò)增GETV全基因序列的引物信息Tab.2 Primers for amplification of all sequences of genes of GETV

1.2.5 GETV全基因序列分析 將測得的12個(gè)序列片段分別在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對,利用DNA Star將所有測序片段及5′和3′進(jìn)行拼接,與GenBank上具有代表性的GETV毒株對序列進(jìn)行相似性分析;用 MEGA 5.0中的鄰接法進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析、繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。序列分析所用參考毒株見表3。

表3 國內(nèi)外參考毒株Tab.3 Domestic and foreign reference strains

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR檢測 病料樣品、細(xì)胞培養(yǎng)物Cap、NSP3基因均為陽性。用GETV特異性Cap和NSP3基因引物對病料樣品和第3代BHK21細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,能夠擴(kuò)增出約316 bp、810 bp的預(yù)期單一目的片段(圖1)。

圖1 病料樣品和第3代細(xì)胞培養(yǎng)物Cap、NSP基因RT-PCR產(chǎn)物擴(kuò)增凝膠電泳圖Fig.1 Gel-electrophoresis of disease material samples,Cap and NSP gene rt-pcr products of third-generation cell culture

2.2 分離到GETV 待測樣品接種到BHK21細(xì)胞連續(xù)傳代3次,經(jīng)蝕斑純化獲得單個(gè)蝕斑克隆(圖2)。同對照組相比,該分離物感染BHK21細(xì)胞和PK15細(xì)胞后約12 h,細(xì)胞出現(xiàn)空洞;24 h后細(xì)胞明顯變圓,部分開始脫落;36 h后大量脫離,貼壁細(xì)胞大部分變圓(圖3)。

細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)RT-PCR鑒定,可擴(kuò)增出GETV的特異性目的條帶,無PRRSV特異性目的條帶。分離物傳至第5代時(shí)用Reed-Muech氏法計(jì)算出細(xì)胞培養(yǎng)物的TCID50為106.85/0.1 mL將其分別命名為SC201807株。

圖2 SC201807株感染BHK21細(xì)胞后的病毒蝕斑圖Fig.2 Virus plaque of SC201807 strain infected with BHK21 cells

圖3 SC201807株感染BHK21細(xì)胞、PK-15細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞病變,放大倍數(shù)為10×20Fig.3 Cell changes after infection of BHK21 cells and PK-15 cells by SC201807 strain,the magnification is 10×20

2.3 獲得SC201807毒株完整全基因組序列 利用12對特異性引物將SC201807基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增,經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、克隆、測序、拼接后,獲得SC201801株全基因組序列,長度為11 691 bp。其堿基 T、C、A、G 占比例分別為19.7%、26.1%、28.0%和26.2%;GC含量為52.3%?；蚪M組成和開放性閱讀框(ORF)大小與GenBank中GETV基本一致,基因組主要包括:5′UTR、3′UTR以及位于兩者之間的兩個(gè)開放閱讀框,其中5′端起始的78個(gè)核苷酸和3′端最后403個(gè)核苷酸為非編碼區(qū)、5′端非編碼區(qū)之后的7 401個(gè)核苷酸編碼構(gòu)4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1、NSP2、NSP3和NSP4),3′端非編碼區(qū)之前的3 759個(gè)核苷酸編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白(C、E3、E2、6K和E1),2個(gè)開放閱讀框之間有44個(gè)核苷酸為非編碼連接。SC201807株全基因序列已上傳至GenBank登錄號為MK693225。

2.4 GETV全基因組序列比對分析 對GETV全基因組核苷酸序列進(jìn)行相似性分析,結(jié)果顯示SC201807與GenBank中上傳的35株GETV序列相似性為99.0%～96.1%,SC201807與中國河南省豬源毒株 HNPDS-2、HNPDS-1、HNNY-1、HNNY-2、HNJZ-S2、HNJZ-S1,中國吉林省蚊源毒株JL17/08、JL1707,河北省蚊源毒株HB0234以及日本蚊源毒株15-I-752、12IH26相似性最高為99.0%;與中國云南省蚊源毒株YN12031相似性最低為96.1%(圖4)。

圖4 SC201807株GETV與參考毒株全基因組核苷酸序列相似性(%)比較Fig.4 Comparison of nucleotide sequence similarity(%)between GETV strain and reference strain of SC201807

2.5 GETV E2蛋白氨基酸突變位點(diǎn)分析SC201807株E2序列的長度為1 266個(gè)核苷酸,在與36株GETV分離株E2蛋白氨基酸序列比對顯示,SC201807株E2氨基酸序列與中國豬源HNPDS-2、HNPDS-1、HNNY-1、HNNY-2、HNJZ-S2、HNJZ-S1,中國蚊源HB0234以及日本蚊源16-I-676、16-I-674、16-I-599、15-I-752、15-I-1105、14-I-605-C2、14-I-605-C1、12IH26株高度保守,僅在E310(天冬氨酸→谷氨酸)發(fā)生突變。SC201807株與MM2021原始株比較共有4個(gè)氨基酸差異,分別為E54(苯丙氨酸→異亮氨酸),E73(絡(luò)氨酸→組氨酸),E310(天冬氨酸→谷氨酸),E342(纈氨酸→異亮氨酸),見圖5。

圖5 SC201807株GETV與參考毒株E2蛋白氨基酸序列比對Fig.5 Comparison of amino acid sequences between GETV of SC201807 strain and E2 protein of reference strain

2.6 遺傳進(jìn)化分析 基于全基因組核苷酸序列遺傳進(jìn)化分析顯示可以將GETV劃分為4個(gè)主要進(jìn)化群體,分別為1組M1株2008年中國海南分離所得,2組1956年日本分離到的GETV SAGV,3組2012年中國蚊蟲中分離到的YN12031株,4組主要包括日本蚊源和中國豬源中分離出來的所有毒株,SC201807株也屬于第4組,其與中國豬源HNJZS2及日本蚊源15-I-752、15-I-1105、14-I-605-C2、14-I-605-C1、12IH26親緣關(guān)系最近,處于同一進(jìn)化分支,如圖6A。

通過E2推導(dǎo)的氨基酸序列遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示,可以根據(jù)E2大致劃分為2個(gè)組,2012年中國云南分離到的YN12031株和2000年俄羅斯分離到的LEIV 16275 Mag株處于同一進(jìn)化分支為1組;其余所有毒株為2組,SC201807屬于2組與中國豬源HNJZ-S2及日本蚊源16-I-676、16-I-674、16-I-599、15-I-752、15-I-1105、14-I-605-C2、14-I-605-C1、12IH26親緣關(guān)系最近屬于同一分支,如圖6B。

圖6 SC201807株GETV與參考毒株全基因序列(A)及E2基因推導(dǎo)的氨基酸序列(B)進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis based on the nucleotide sequences corresponding to the complete genome of isolate SC201807(A)and deduced amino acids sequences of E2gene(B)

3 討 論

1955年發(fā)現(xiàn)GETV至今,血清學(xué)檢測結(jié)果顯示,GETV廣泛分布在亞洲、大洋洲,在多種動(dòng)物體內(nèi)均能檢測到GETV抗體,因此被確定為重要的動(dòng)物源性病原體[8]。盡管尚未有引起人類疾病的報(bào)道,但人的血清樣本中普遍能檢測到GETV病毒中和抗體,因此目前人們一般把該病看做人獸共患病[9]。

目前我國對GETV的研究主要局限于人群中血清流行病學(xué)調(diào)查和庫蚊體內(nèi)病毒分離[10-12],至于蚊子體內(nèi)的病毒從何而來以及動(dòng)物在該病毒傳播過程中所起的作用尚不得而知,GenBank中收錄眾多的中國來源GETV毒株,包括大量蚊源和個(gè)別豬源、狐貍源及蠓源[13]毒株。近兩年來中國開始報(bào)道分離到豬源的GETV,由周峰等[3]于2017年報(bào)道分離到,并在山西、湖北、河南、安徽四省豬場中檢測出37份陽性樣本,同時(shí)2017年在湖南省豬群中發(fā)生了大規(guī)模GETV的感染,造成大量仔豬死亡,母豬流產(chǎn)并導(dǎo)致了重大經(jīng)濟(jì)損失[19]。

研究GETV的來源、在我國的生態(tài)學(xué)分布、對動(dòng)物和人的致病性、確定其終末宿主以及蚊子是否在人和動(dòng)物間扮演媒介角色等均具有重要的公共衛(wèi)生意義和動(dòng)物生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。本研究從四川某豬場流產(chǎn)胎兒體內(nèi)分離到首株GETV,不僅擴(kuò)大其感染譜,也為GETV可以感染豬群引起臨床發(fā)病提供了充分證據(jù),為今后深入開展其他相關(guān)研究提供了寶貴的研究素材,同時(shí)也為人群感染GETV的相關(guān)研究開辟了一片新領(lǐng)域。

我國作為世界養(yǎng)豬與豬肉消費(fèi)第一大國,人們接觸生豬及其產(chǎn)品的機(jī)會甚多,因此,豬病流行動(dòng)態(tài)與人類健康密切相關(guān)。蓋塔病毒屬于人獸共患病,本研究不僅為公共衛(wèi)生安全提出新的警示,也向探明該病毒的傳播鏈條邁近了一步。另外值得注意的是,本研究是從混合感染豬繁殖與呼吸綜合征的仔豬血液中分離得到的GETV,在進(jìn)行分離鑒定時(shí)首先選用BHK21細(xì)胞進(jìn)行分離并純化,排除了PRRSV的干擾。在蔣正軍豬繁殖和呼吸障礙綜合征(PRRS)病毒囊膜糖蛋白(GP5)自身抗獨(dú)特型抗體的鑒定報(bào)道中指出,感染PRRSV后1～2月才出現(xiàn)中和抗體,這就導(dǎo)致感染PRRSV后一定時(shí)期內(nèi)免疫缺陷[20],PRRSV是一種免疫缺陷病,感染后機(jī)體免疫系統(tǒng)損傷,會造成混合或繼發(fā)感染[14],推測本研究中的GETV和PRRSV混合感染可能是由于其免疫缺陷導(dǎo)致;而引起母豬流產(chǎn)的病毒種類甚多,包括日本腦炎病毒(JEV)、偽狂犬病病毒(PRV)、PRRSV、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)豬細(xì)小病毒(PPV)和CSFV等。近年來病豬混合感染的概率不斷攀升,其中PRRSV和PCV均屬于免疫缺陷病,袁婧等[15]在報(bào)道中指出,PCV2與多種病原混合感染的現(xiàn)象十分普遍。推測GETV與這2種病毒的混合感染概率較高,王新港等[21]通過建立PRRSV與GETV的雙重RT-PCR對河南省136份臨床疑似PRRSV樣品進(jìn)行檢測,共檢出PRRSV陽性樣品52份(38.2%),GETV陽性樣品15份(11.2%),結(jié)果也表明GETV與PRRSV混合感染比例較高;在周峰等[16]流行病學(xué)調(diào)查報(bào)道中也證實(shí)了此推測,雖然GETV與各個(gè)病原混合感染之間的機(jī)制尚不清楚,但在臨床研究中開展流行病學(xué)調(diào)查和建立混合感染檢測方法,并分析其流行病學(xué)特征十分有必要。

將SC201807與Gen Bank數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的36株GETV全基因組核苷酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn),序列與近期公布的中國豬源毒株HNPDS-2、HNPDS-1、HNNY-1、HNNY-2、HNJZ-S2、HNJZ-S1以及日本蚊源毒株15-I-752、12IH26高度相似,即為99.0%,但與中國云南省蚊源毒株YN12031相似性最低為96.1%。通過對E2蛋白氨基酸序列突變位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)GETV的結(jié)構(gòu)蛋白E2基因高度保守[17],E2編碼的結(jié)構(gòu)蛋白是病毒的抗原識別位點(diǎn)和中和位點(diǎn),在吸附靶細(xì)胞、感染宿主以及誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗感染免疫中充當(dāng)重要角色,SC201807株E2氨基酸位點(diǎn)與中國豬源HNPDS-2、HNPDS-1、HNNY-1、HNNY-2、HNJZ-S2、HNJZ-S1,中國蚊源HB0234以及日本蚊源16-I-676、16-I-674、16-I-599、15-I-752、15-I-1105、14-I-605-C2、14-I-605-C1、12IH26株高度保守,僅在E310(天冬氨酸→谷氨酸)發(fā)生突變,氨基酸的穩(wěn)定性更有利于基于E2蛋白開發(fā)的疫苗上產(chǎn)生交叉保護(hù)性。通過對全基因組核苷酸序列和E2蛋白氨基酸序列繪制遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示,SC201807株與中國豬源HNJZ-S2及日本蚊源15-I-752、15-I-1105、14-I-605-C2、14-I-605-C1、12IH26親緣關(guān)系最近,處于同一進(jìn)化分支;在李媛媛[17]的報(bào)道中將GETV大致劃分為4個(gè)主要進(jìn)化群體,除原始株 MM2021、GETV SAGV、YN12031其余所有從中國,日本,韓國和蒙古在1964年至2014年從蚊子,豬,馬和其他動(dòng)物中分離出來的所有毒株劃分為同一組群,根據(jù)本研究的遺傳進(jìn)化分析中SC2101807株也屬于此組群,同時(shí)中國豬源與日本蚊源的核苷酸序列高度同源以及在遺傳進(jìn)化中也處于同一分支表明中國豬源蓋塔的傳入與日本蚊源的相關(guān)性較大。

HiroshiBannai等[18]首次報(bào)道了2種不同動(dòng)物馬群與豬群之間蓋他病毒感染與發(fā)病的地理空間和時(shí)間關(guān)系,表明2010-2015年期間豬群的蓋他病毒陽性率在不斷上升;而2014-2015年期間豬群與馬群的GETV感染具有同步性;從豬群和馬群分離的GETV其核苷酸全序列具有99.89%～99.94%的相似性。該研究結(jié)果提示上述2種家畜之間的GETV感染存在密切相關(guān)性,但究竟是什么因子在這種相關(guān)性中起媒介作用尚無確切證據(jù)。李媛媛等[22]對云南省家畜進(jìn)行蓋塔病毒血清學(xué)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)其在雞,鴨,奶牛,豬和肉牛的血清樣本中均檢測到GETV抗體,表明當(dāng)?shù)乜赡苡写罅康腉ETV宿主動(dòng)物,媒介傳播造成多種動(dòng)物之間感染機(jī)制也尚不清楚。目前已知GETV有較強(qiáng)的宿主性,侵害多種動(dòng)物的胎兒和新生兒,臨床中重要的是監(jiān)測GETV感染發(fā)生率,但因此如果只對正常人群進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查,而忽視對孕婦、產(chǎn)婦、新生兒及流產(chǎn)胎兒等重點(diǎn)對象進(jìn)行深入研究,可能很難掌握該病毒對人類的真實(shí)危害程度。

盡管GETV進(jìn)入人們視野已長達(dá)60余年,但對其危害及影響程度尚未清楚,隨著各種相關(guān)研究的不斷深入,相信人們將會對GETV具有更全面的了解和認(rèn)識,從而為防治提出科學(xué)依據(jù)。

利益沖突:無

引用本文格式:江朝源,李飛,曾喻兵,等.四川省豬源蓋塔病毒的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2019,35(9):805-814.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.112