朱志翠,鄧思波,張迎春,吳 坤,馬曉琳,吳建偉,王 濤

流行性感冒是一種急性呼吸道傳染病,多由甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)引起。由于全球每年感染的病例數(shù)量龐大、傳播速度快且病毒變異性強(qiáng),流感已成為嚴(yán)重威脅公眾健康的病毒性傳染病之一[1-2]。目前,對流感的主要防治措施主要是疫苗接種和化學(xué)藥物治療。流感病毒變異性強(qiáng),增加了流感疫苗制備的難度,也使疫苗的有效性大大降低[3-7]。隨著耐藥病毒株的不斷出現(xiàn),現(xiàn)有的抗流感病毒藥物已無法滿足臨床需求[8-11]。因此,尋求新型抗流感病毒藥物已成為迫切需要解決的問題。

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是生物體內(nèi)對細(xì)菌、病毒、真菌等微生物和腫瘤細(xì)胞具有抑殺活性的小分子多肽。由于具有廣譜抗微生物活性、低毒、不容易產(chǎn)生耐藥性等特征,AMPs被認(rèn)為是新型抗生素的理想候選者[12-13]。MAF-1A(Musca domesticaantimicrobial peptide-1A)來源于家蠅,由26個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小分子抗菌肽[14]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),MAF-1A具有抗流感病毒作用,具有研發(fā)新型抗流感病毒藥物的潛力,但MAF-1A抗流感病毒活性及其作用機(jī)制尚未清楚[15]。本文在此基礎(chǔ)上,探討MAF-1A抗IAV活性和作用機(jī)制,為MAF-1A的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 MAF-1A的化學(xué)合成 抗菌肽 MAF-1A序列為KKFKETADKLIESAKQQLESLAKEMK,委托生工生物工程(上海)股份有限公司采用FMOC固相合成法合成,高效液相色譜(HPLC)純化、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)驗(yàn)證,多肽合成純度≥98%。

1.1.2 細(xì)胞和病毒 狗腎細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究所;甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)為本室保存。

1.1.3 主要試劑 胎牛血清購自德國PAN公司;神經(jīng)氨酸酶抑制劑篩選試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;RNAiso Plus試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix ExTaqTMⅡ)均購自TaKaRA(大連)有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司;磷酸奧司他韋購自上海麥克林生化科技有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.1.4 引物合成 委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成IAV的qRT-PCR檢測基因和內(nèi)參基因引物HA-F:CCTG CTCGAAGACAGCCACAACG,HA-R:GCTCCCTCAGCTCCTCATAGTCG;GAPDH-F:AGGGCAATGCCAGCCCCAG CG,GAPDH-R:AGGGCAATGCCAGCCCCAGCG。

1.2 方 法

1.2.1 MAF-1A抗IAV活性檢測

1.2.1.1 病毒的增殖 按文獻(xiàn)[16]方法,將IAV 稀釋液接種于9日齡雞胚尿囊腔,37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育至48 h,收獲尿囊液,檢測血凝效價(jià)。

1.2.1.2 MDCK 細(xì)胞培養(yǎng) MDCK 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞生長至70%～90%,取0.5%胰蛋白酶進(jìn)行消化成單個(gè)細(xì)胞,按2×104個(gè)∕孔接種于96孔板,待細(xì)胞生長至90%單層細(xì)胞時(shí)備用。

1.2.1.3 病毒對 MDCK 細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)測定 將上述96孔板生長的MDCK細(xì)胞,去培養(yǎng)液,PBS洗滌3次,將病毒液以10倍系列稀釋,分別以100μL/孔接種于單層MDCK細(xì)胞,2 h后去掉病毒液,PBS緩沖液洗滌3次,加入等量細(xì)胞維持液,每個(gè)稀釋度重復(fù)6個(gè)復(fù)孔,設(shè)細(xì)胞培養(yǎng)組為陰性對照,48 h后觀察并記錄細(xì)胞的病變效應(yīng);并參照文獻(xiàn)[17]方法,按Reed-Muench法計(jì)算病毒對細(xì)胞的半數(shù)感染量TCID50。試驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.2.1.4 MAF-1A 對IAV 半數(shù)有效濃度(EC50)檢測 取100×TCID50病毒稀釋液50μL與等體積MAF-1A溶液混勻,使MAF-1A終濃度為15.6μg/mL、31.2μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL。將混合液于37℃預(yù)處理30 min后,接種于單層MDCK細(xì)胞,2 h后去除液體,PBS緩沖液洗滌3次,以100μL/孔加入細(xì)胞維持液,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,鏡下觀察細(xì)胞CPE效應(yīng);MTT法檢測MAF-1A抗病毒有效率。同時(shí),設(shè)置細(xì)胞培養(yǎng)組和病毒組為對照組,奧司他韋為藥物對照組,MAF-1A對流感病毒抑制率(%)按公式計(jì)算,并參考文獻(xiàn)[18],采用Probit回歸法計(jì)算半數(shù)有效濃度EC50:

1.2.1.5 qRT-PCR檢測MDCK細(xì)胞內(nèi)的病毒載量 取100×TCID50病毒稀釋液50μL與等體積MAF-1A溶液混勻,使MAF-1A終濃度為250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.2μg/mL、15.6 μg/mL。將混合液于37℃預(yù)處理30 min后,接種于6孔板中90%單層MDCK細(xì)胞,2 h后去混合液,用PBS緩沖液洗滌3次,每孔加入100μL細(xì)胞維持液,于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,根據(jù)TaKaRA公司的RNAiso Plus和Prime-ScriptTMRT Master Mix試劑盒使用說明書,提取細(xì)胞Total RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,于-20℃保存?zhèn)溆?。參考文獻(xiàn)[19],使用qRT-PCR反應(yīng)試劑盒以管家基因GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法對HA基因mRNA水平進(jìn)行相對定量。反應(yīng)條件為:95℃30 s,95℃5 s,60℃30 s,共40個(gè)循環(huán)。

1.2.2 MAF-1A對 MDCK細(xì)胞的毒性檢測 將MDCK細(xì)胞以2×104個(gè)/孔接種于96孔板,待其長成90%單層細(xì)胞備用;將MAF-1A溶液進(jìn)行倍比稀釋至10～2 500μg/mL,以上濃度梯度的MAF-1A以每孔100μL加入細(xì)胞中,每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,并設(shè)正常對照組(只加入細(xì)胞維持液),置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24 h后倒置顯微鏡下觀察CPE。棄孔內(nèi)培養(yǎng)基后用PBS洗滌3遍,以10μL/孔加入5 mg/mL的MTT液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后去上清液,每孔加入DMSO 150μL,振蕩搖勻15 min,在酶標(biāo)儀490 nm波長下測定各孔吸光度值(OD),按公式計(jì)算 MAF-1A對MDCK細(xì)胞的抑制率[18]。

1.2.3 MAF-1A抗流感病毒作用機(jī)制分析

1.2.3.1 MAF-1A 對IAV形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 按文獻(xiàn)[20]方法,采用醛化雞紅細(xì)胞吸附釋放法對含甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)雞胚尿囊液進(jìn)行純化,并檢測純化后病毒的血凝效價(jià)。將純化的病毒液50μL與等體積MAF-1A系列稀釋液充分混合,37℃孵育30 min,用0.1%甲醛溶液于37℃滅活48 h,以2%磷鎢酸負(fù)染色液進(jìn)行染色,經(jīng)透射電鏡觀察病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.3.2 血凝抑制試驗(yàn) 將25μL 不同濃度的MAF-1A與等體積4倍血凝效價(jià)的病毒液混合,于室溫孵育30 min后,每孔加入1%c RBC懸液50 μL,室溫(20℃～25℃)靜置40 min后觀察結(jié)果,每個(gè)濃度作3個(gè)復(fù)孔。同時(shí),設(shè)置病毒組和PBS陰性對照組,試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.3 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn) 按試劑盒說明書操作,在96孔熒光酶標(biāo)板內(nèi)每孔加70μL神經(jīng)氨酸酶檢測緩沖液,然后每孔加入10μL神經(jīng)氨酸酶,再每孔加入10μL各濃度的 MAF-1A,振動搖勻1 min后于37℃ 孵育2 min;加入10μL的神經(jīng)氨酸酶熒光底物,再振蕩1 min,37℃孵育20 min進(jìn)行熒光測定。根據(jù)試劑盒方法計(jì)算出樣品對神經(jīng)氨酸酶的抑制百分比。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以 (±s)表示,采用SPSS20.0軟件以方差分析檢驗(yàn)各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病毒滴度及毒力的檢測 經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)在雞胚中擴(kuò)增后,其血凝效價(jià)為1∶1 280;甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)對 MDCK細(xì)胞的TCID50為1.0×10-5.2/mL。

2.2 MAF-1A對MDCK細(xì)胞的毒性 MTT結(jié)果顯示,當(dāng)MAF-1A的濃度達(dá)2 500μg/mL時(shí),仍對MDCK細(xì)胞的生長無明顯抑制作用;鏡下可見,經(jīng)MAF-1A作用后細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性與對照組相比未見明顯差異。MAF-1A對MDCK細(xì)胞表現(xiàn)出較小的細(xì)胞毒性。

2.3 MAF-1A抗流感病毒活性 鏡下可見,甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)可導(dǎo)致MDCK細(xì)胞變圓,壞死脫落,漂浮在培養(yǎng)液表面。但隨 MAF-1A濃度的增高,甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)病毒所致的CPE不斷減弱,當(dāng)濃度達(dá)500 μg/mL時(shí),MDCK細(xì)胞完整性好,形態(tài)規(guī)則,正常細(xì)胞數(shù)量與陰性對照組無明顯差異(圖1)。經(jīng)MTT法檢測,MAF-1A具有抗甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)活性,MAF-1A對病毒的EC50值為(89.8±2.97)μg/mL,且濃度越大,對甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的抑制率越高(圖2)。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,與IAV組比較,不同劑量(250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.2μg/mL、15.6μg/mL)的MAF-1A顯著抑制了IAV HA mRNA的表達(dá)(t＝7.39、6.66、5.78、4.75、5.26,P＜0.01),并呈劑量依賴性(圖3)。

2.4 MAF-1A對病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 透射電鏡檢測結(jié)果顯示,未經(jīng)藥物處理的病毒對照組病毒顆粒結(jié)構(gòu)完整,而在MAF-1A的作用下,病毒的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化,隨著MAF-1A作用濃度升高,變化更加明顯,當(dāng)濃度達(dá)500μg/mL時(shí),病毒顆粒被完全破壞(圖4)。

2.5 血凝抑制試驗(yàn) MAF-1A對流感病毒引起的雞紅細(xì)胞凝集具有明顯抑制作用,當(dāng)濃度為1.56 μg/mL時(shí)即可抑制流感病毒引起的雞紅細(xì)胞凝集(圖5A)。而MAF-1A與雞紅細(xì)胞單獨(dú)作用時(shí),不會引起雞紅細(xì)胞的凝集(見圖5B)。

2.6 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn) 結(jié)果顯示,MAF-1A與陽性對照藥物奧司他韋相似,也具有抑制甲型流感病毒神經(jīng)酸酶的作用,MAF-1A濃度增高,抑制效果越明顯,其半數(shù)抑制濃度IC50為(134.7±10.31)μg/mL(圖6)。

圖1 MAF-1A抑制流感病毒A/PR/8/34(H1N1)在MDCK細(xì)胞中誘導(dǎo)的CPE(×400)Fig.1 MAF-1A inhibited the influenza A/PR/8/34(H1N1)virus induced CPE in MDCK cells(×400)

圖2 MAF-1A抗甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)活性Fig.2 Inhibition rate of the influenza A/PR/8/34(H1N1)virus by MAF-1A

圖3 MAF-1A處理后甲型流感病毒HA基因mRNA水平的變化Fig.3 The mRNA level of influenza A/PR/8/34(H1N1)virus HA gene after treatment with MAF-1A

圖4 不同濃度MAF-1A對甲型流感病毒H1N1形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響(×30 000)Fig.4 Effects of MAF-1A on morphological structure of virus(×30 000)

圖5 MAF-1A血凝抑制試驗(yàn)Fig.5 Hemagglutinin inhibition assay for MAF-1A

3 討 論

圖6 MAF-1A對神經(jīng)氨酸酶活性的影響Fig.6 Neuraminidase inhibition assay for MAF-1A

目前流感的防治主要依靠藥物和疫苗,但由于耐藥病毒株的不斷出現(xiàn)以及疫苗作用的局限性,探尋新型、有效的抗流感藥物已成為必然。MAF-1A是來源于家蠅幼蟲體內(nèi)的一類新型小分子AMPs,實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其對多種病毒、真菌具有的抑殺活性,具有新型肽類藥物的開發(fā)潛能[15]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,MAF-1A可抑制甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)在MDCK細(xì)胞中誘導(dǎo)的CPE,能有效降低MDCK細(xì)胞內(nèi)的病毒載量;MAF-1A對甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)的EC50值為(89.8±2.97)μg/mL,其對病毒的抑制作用呈劑量相關(guān)性,而MAF-1A對MDCK細(xì)胞的毒性小。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),MAF-1A具有較強(qiáng)的抗甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)活性,且毒性較低,表明其具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

探明AMPs的抗病毒作用機(jī)制對研究AMPs生物學(xué)特性、開發(fā)新的抗病毒藥物非常重要。研究報(bào)道,BPI、LL-37等抗菌肽可破壞病毒顆粒的結(jié)構(gòu),直接殺滅流感病毒[21-23]。本實(shí)驗(yàn)通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),MAF-1A在低濃度下即可改變流感病毒的電子密度,隨著濃度增加,對病毒結(jié)構(gòu)破壞越明顯,表明MAF-1A能夠直接破壞流感病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性,導(dǎo)致其不能正常復(fù)制增殖。

流感病毒的包膜蛋白包括HA和NA。病毒進(jìn)入靶細(xì)胞是由病毒包膜上的HA介導(dǎo)的。HA由HA1和HA2兩個(gè)亞基構(gòu)成,其中 HA1亞基與易感細(xì)胞膜表面的唾液酸受體結(jié)合,病毒通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。有文獻(xiàn)報(bào)道,AMPs可以通過與流感病毒HA相互作用,阻斷其與宿主細(xì)胞的吸附或融合過程,從而有效抑制流感病毒感染[24-26]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MAF-1A能阻止血凝素HA1亞基的血凝作用,因此認(rèn)為血凝素HA1亞基是其抗流感病毒的作用位點(diǎn),MAF-1A可能通過與血凝素HA1亞基結(jié)合而阻止流感病毒吸附宿主細(xì)胞。

流感病毒由細(xì)胞內(nèi)出芽釋放時(shí),需借助自身的NA切斷病毒蛋白和宿主細(xì)胞表面唾液酸之間的連接,才能使子代病毒釋放至胞外,感染其他宿主細(xì)胞[21-25]。奧司他韋是NA抑制劑,選擇性地抑制其活性,干擾流感病毒從細(xì)胞的釋放,從而達(dá)到抗流感病毒的作用[27]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MAF-1A也能抑制NA的活性,表明對NA的抑制可能也是其抗流感病毒作用機(jī)制之一。

綜上,MAF-1A不僅能夠直接破壞流感病毒的結(jié)構(gòu),還可以阻止流感病毒的吸附,干擾流感病毒的釋放,提示MAF-1A是通過對多靶點(diǎn)作用而發(fā)揮抗流感病毒效應(yīng),但其抗流感病毒關(guān)鍵機(jī)制及其與靶點(diǎn)的結(jié)合模式有待進(jìn)一步研究。本研究為MAF-1A的深入探討和開發(fā)、利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突:無

引用本文格式:朱志翠,鄧思波,張迎春,等.家蠅抗菌肽MAF-1A體外抗甲型流感病毒活性及機(jī)制研究[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2019,35(9):791-796.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.085