南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院腎病風(fēng)濕科，河南 南陽(yáng) 473000

腎缺血再灌注損傷(Renal Ischemical Reperfusion Injury，RIRI)是指在腎缺血的基礎(chǔ)上，當(dāng)恢復(fù)血流灌注后，損傷不僅沒(méi)有改善，反而加重的現(xiàn)象[1]。RIRI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中繼發(fā)性的細(xì)胞凋亡可能起到重要作用[2]，通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)作為治療的靶點(diǎn)，為研究開(kāi)發(fā)新型藥物開(kāi)辟了新的途徑。從中醫(yī)學(xué)的角度來(lái)看，細(xì)胞凋亡與中醫(yī)正氣學(xué)說(shuō)有密切聯(lián)系[3]。RIRI根據(jù)其臨床表現(xiàn)可將其歸于“關(guān)格”“虛勞”“溺毒”“癃閉”等范疇，其病因病機(jī)皆與脾腎有關(guān)，脾腎兩虛易致濁毒內(nèi)蘊(yùn)、邪氣增多[4]?！端貑?wèn)·通評(píng)虛實(shí)論》曰：“邪氣盛則實(shí)，精氣奪則虛”。

黃芪為豆科類植物膜莢黃芪或者蒙古黃芪干燥后的根，其味甘、性微溫，歸脾肺經(jīng)?！侗静輩R言》贊其為“補(bǔ)肺健脾，實(shí)衛(wèi)斂汗，驅(qū)風(fēng)運(yùn)毒之藥也”。國(guó)內(nèi)外研究表明其具有保護(hù)腎臟，對(duì)腎臟疾病具有治療作用[5]。黃芪多糖(Astragalus Polysac charides，APS)為黃芪的有效成分之一，在心肌[6]、腦[7]的缺血再灌注損傷中具有抗細(xì)胞凋亡的作用。腎臟作為缺血再灌注損傷的常見(jiàn)器官之一，APS是否通過(guò)抗細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對(duì)RIRI的保護(hù)作用，還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)在大鼠體內(nèi)復(fù)制RIRI模型，從抗細(xì)胞凋亡角度分析APS對(duì)RIRI作用的機(jī)制，以期為臨床APS的運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性成年S-D大鼠30只，體重200～300 g左右，購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，編號(hào)：SXYK180605120。分組飼養(yǎng)，室溫控制在20～25 ℃，空氣濕度控制在50%～55%，飲食與飲水均標(biāo)準(zhǔn)化供給。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑 APS(批號(hào)：1803152230，上?？抵壅婢嗵枪?；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：18I03AJ，武漢博士德生物工程有限公司)；肌酐(Cr)試劑盒、尿素氮(BUN)試劑盒均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所，批號(hào)皆為201809036；Bax(Bcl-2 associated X蛋白質(zhì)，批號(hào)：2343179)、Bcl-2(B淋巴細(xì)胞瘤-2基因，批號(hào)：185641)免疫組化試劑盒購(gòu)自于武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 儀器 7020型全自動(dòng)生化分析儀(日本HITAHI公司)；TS-12U型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；TDK-BMB型石蠟冰凍切片機(jī)(浙江金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠)；顯微鏡(日本尼康公司)；DMR+Q550型病理圖像分析儀(德國(guó)Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模和分組 30只大鼠隨機(jī)分為3組：模型組、假手術(shù)組和APS干預(yù)組，每組10只。手術(shù)前12 h禁食不禁水，各組動(dòng)物以45 mL/kg劑量戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行全身麻醉。仰臥位固定，沿腹正中切開(kāi)腹部，模型組大鼠游離雙側(cè)腎臟并分離腎動(dòng)脈，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈60 min，然后松開(kāi)動(dòng)脈夾，腎臟由紫黑色變?yōu)轷r紅，表明模型制備成功，如果松開(kāi)動(dòng)脈夾5 min后，腎臟顏色沒(méi)有變?yōu)轷r紅色，說(shuō)明模型制作失敗，這種大鼠被剔除。假手術(shù)組只沿腹正中切開(kāi)腹部，并分離左右腎臟，不夾閉腎動(dòng)脈。APS干預(yù)組在模型制作前給予450 mg/kg APS灌胃，連續(xù)用藥10 d，1次/d，假手術(shù)組與模型組給予等量的生理鹽水灌胃。各組大鼠手術(shù)后單籠常規(guī)飼養(yǎng)，48 h后腎動(dòng)脈采血，然后處死大鼠并摘取腎臟組織。

1.2.2 血清BUN、Cr含量測(cè)定 將采集的血液，以3 000 r/min離心15 min后提取血清。參照說(shuō)明書通過(guò)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中的BUN、Cr含量。

1.2.3 TUNEL法檢測(cè)腎臟細(xì)胞凋亡 取腎組織固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，嚴(yán)格參照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書對(duì)腎臟凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。光鏡下凋亡細(xì)胞核染色為棕黃色。在顯微鏡(×400)下，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)非重疊視野進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目，取平均值，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)，具體公式為：細(xì)胞凋亡指數(shù)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%

1.2.4 免疫組化檢測(cè)腎組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 制備腎組織切片，用SABC免疫組化染色法檢測(cè)Bax、Bcl-2的表達(dá)，操作步驟嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書。Bax和Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性結(jié)果為胞漿染色呈棕色，不著色者為陰性。在顯微鏡(×400)下，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)非重疊視野進(jìn)行觀察，計(jì)算陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)域面積的平均光密度值(OD)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清BUN、Cr水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清BUN和Cr含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，APS干預(yù)組大鼠血清BUN和Cr含量明顯下降(P<0.01)。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清BUN和Cr水平比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2 各組大鼠細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 與假手術(shù)組比較，模型組腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，APS干預(yù)組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.01)。具體結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.3 各組大鼠腎組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組腎臟Bax表達(dá)明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，APS干預(yù)組大鼠腎臟Bax表達(dá)明顯降低，Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.01)。具體結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。

組別BaxBcl-2假手術(shù)組0.38±0.060.95±0.15模型組0.85±0.13?0.46±0.06?APS干預(yù)組0.56±0.85#0.76±0.11#

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

RIRI是因腎供血障礙后血流再灌注而導(dǎo)致的常見(jiàn)的應(yīng)激性疾病，臨床最常見(jiàn)于腎移植術(shù)后[8]。RIRI導(dǎo)致腎臟血管損傷，引發(fā)腎小管代謝紊亂甚至壞死，進(jìn)而影響腎血流，最終導(dǎo)致腎細(xì)胞凋亡、壞死，直至腎功能衰竭。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清BUN和Cr含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，APS干預(yù)組大鼠血清BUN和Cr含量明顯下降(P<0.01)。提示RIRI大鼠腎功能下降，通過(guò)APS干預(yù)作用后腎功能得到改善，說(shuō)明APS對(duì)RIRI大鼠腎臟具有保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定生理或病理?xiàng)l件下，通過(guò)啟動(dòng)內(nèi)部自身機(jī)制，激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶而引起自身細(xì)胞死亡的現(xiàn)象[9]，其在RIRI病理生理中發(fā)揮重要作用[10]。細(xì)胞凋亡與多種基因表達(dá)有關(guān)，其中Bcl-2家族為現(xiàn)在研究較為深入的調(diào)控基因之一。迄今已發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族包括20多種成員，按其功能可分為抑制凋亡的亞家族(包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、mcl-1、A1/Bfl-1等)和促進(jìn)凋亡的Bax亞家族(包括Bax、Bcl-XS、Bad、Bik、Bak、Bid、Hrk等)，其中Bcl-2和Bax是最主要的成員。Bcl-2具有抗細(xì)胞凋亡作用，而B(niǎo)ax具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，在正常情況下Bcl-2與Bax調(diào)控作用保持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)Bcl-2表達(dá)程度升高或者Bax的表達(dá)程度受到抑制時(shí)，就會(huì)抑制細(xì)胞凋亡[11]，這種抑制的機(jī)理包括以下幾種可能：①對(duì)促細(xì)胞凋亡基因信號(hào)傳達(dá)產(chǎn)生阻隔作用，或使得相關(guān)基因失效[12]；②Ca2+內(nèi)流在細(xì)胞中發(fā)生變化，使凋亡受到抑制；③抑制氧自由基的產(chǎn)生，減少氧化應(yīng)激等。而B(niǎo)ax表達(dá)的增強(qiáng)，使線粒體通透性增大，進(jìn)而使細(xì)胞內(nèi)引入大量的細(xì)胞色素C，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。通過(guò)本研究顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，且Bax表達(dá)明顯升高、Bcl-2表達(dá)明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，APS干預(yù)組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低，且Bax表達(dá)明顯降低、Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.01)。說(shuō)明APS通過(guò)對(duì)凋亡基因進(jìn)行調(diào)節(jié)的作用，抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)腎臟，避免產(chǎn)生腎損傷。

黃芪作為傳統(tǒng)名貴中藥，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、行水消腫和托毒生肌的功效，有“補(bǔ)氣諸藥之最”之稱。APS作為黃芪中最重要的一種藥用物質(zhì)，大量實(shí)驗(yàn)證明其具有抗細(xì)胞凋亡的作用。綜上所述，APS預(yù)處理具有減輕腎臟細(xì)胞凋亡，改善RIRI腎功能的作用，其機(jī)制可能與Bax蛋白表達(dá)下調(diào)，以及Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。