(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

引言

松針為松科植物的多個(gè)品種的針狀葉,又名松葉、松毛等[1]，資源分布廣泛，儲(chǔ)量豐富，據(jù)估算我國(guó)每年約產(chǎn)200～300萬(wàn)t[2]。松針中含有多糖、蛋白質(zhì)、微量礦物元素、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)[3、4、5]，具有促進(jìn)血液循環(huán)、降壓降脂、抗氧化等功效[6]，且在我國(guó)古代已有食用歷史[7-9]。隨著現(xiàn)代研究的不斷深入，松針的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值日益受到關(guān)注[10]。因其含有的多種生物活性成分，其活性成分的提取和功能活性的研究成為近年研究的熱點(diǎn)，相關(guān)產(chǎn)品已被在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用[5]，但利用松針開(kāi)發(fā)松針醋的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以松針為原料，開(kāi)發(fā)優(yōu)化松針醋的醋酸發(fā)酵工藝，以期在滿(mǎn)足日常調(diào)味所需的同時(shí)，發(fā)揮松針的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，同時(shí)豐富松針的產(chǎn)品類(lèi)型，也可為松針資源開(kāi)發(fā)和利用提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 原料與菌種：松針(采自商洛市商州區(qū))；釀酒酵母、醋酸菌等均為市售；

試劑：CaCl2，NaOH等均為分析純。

1.1.2 儀器 蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng))，恒溫水浴鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)，分光光度計(jì)(上海精科儀器有限公司)，生化培養(yǎng)箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)，電子天平(丹佛儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 原料處理 挑選新鮮松針，經(jīng)清洗風(fēng)干后粉碎，加入果膠酶(0.05%)，按料水比1:20加水保溫(50℃)15 min備用；將大米、麩皮、小麥等按料液比為1:5加入已制備的松針浸提液中，并置于65℃下浸泡2 h后，磨漿煮沸15 min，降溫并加入0.2% CaCl2后，待溫度降至60℃后，按0.6 g·kg-1加入α-淀粉酶，并保溫約2 h，然后按100～200 U·g-1加入糖化酶，繼續(xù)保溫1 h，隨后升溫至100℃，維持15 min，冷卻至常溫備用。

1.2.3 酒精發(fā)酵 稱(chēng)取原料質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.4% 的酵母菌，加適當(dāng)蒸餾水，恒溫(30℃)水浴30 min進(jìn)行活化，然后倒入經(jīng)2.2.2方法制備并調(diào)整糖度至25%，pH為4.5～5.0的原料液中，攪拌均勻后恒溫(30℃)發(fā)酵4 d，待乙醇含量不在升高時(shí)結(jié)束發(fā)酵。

1.2.4 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化 將醋酸菌經(jīng)活化培養(yǎng)，添加至1.2.3的發(fā)酵液中，并單一調(diào)整醋酸菌發(fā)酵液初始乙醇含量為5.5%、7.0%、8.5%、10%、11.5%，菌種添加量為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，發(fā)酵溫度為30℃、33℃、36℃、39℃、42℃，發(fā)酵時(shí)間1.5 d、2 d、2.5 d、3 d、3.5 d，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1、120 r·min-1、140 r·min-1、160 r·min-1、180 r·min-1，按照上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總酸含量為指標(biāo)優(yōu)化工藝參數(shù)。

1.3 測(cè)定方法

總酸含量：酸堿滴定法測(cè)定，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18187-2000。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始乙醇含量對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的影響

圖1 初始乙醇含量對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的影響

由圖1可知，初始乙醇含量對(duì)醋酸發(fā)酵過(guò)程中的總酸含量有一定的影響作用。當(dāng)初始乙醇含量在5.5%～10%時(shí)，隨初始乙醇含量的增大，醋酸發(fā)酵的總酸含量逐漸上升，最高為6.64 g·100 mL-1；當(dāng)初始乙醇含量大于10%后，隨初始乙醇量的繼續(xù)增大，總酸含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。其原因可能是乙醇作為醋酸菌生長(zhǎng)繁殖提供基質(zhì)，在合適的范圍內(nèi)，乙醇含量越高，產(chǎn)酸量就越高，但同時(shí)醋酸菌的耐受力是有限的，當(dāng)發(fā)酵液的初始乙醇含量增大到一定程度后，引起醋酸菌生長(zhǎng)產(chǎn)生異常或者正常代謝減慢，進(jìn)而導(dǎo)致醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸的生成量下降[11、12]。

2.2 醋酸菌添加量對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的影響

圖2 醋酸菌添加量對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的影響

由圖2可知，醋酸菌添加量對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中的總酸含量有一定的影響作用，隨醋酸菌接種量的增大，醋酸發(fā)酵過(guò)程中的總酸含量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)醋酸菌接種量為0.2%～0.4%時(shí)，隨著醋酸菌添加量的增加，松針醋的總酸含量隨之不斷升高，最大值約為5.90 g·100 mL-1；當(dāng)醋酸接種量高于0.4%后，隨醋酸菌添加量的繼續(xù)增加，松針醋的總酸含量酸度開(kāi)始呈現(xiàn)大幅下降。這可能是當(dāng)醋酸接種量較小時(shí)，底物充足，隨接種量的增大，酒精轉(zhuǎn)化率升高，總酸的產(chǎn)酸量明顯增加；但當(dāng)接種量超過(guò)一定的限度之后，隨接種量的持續(xù)增大，醋酸菌自身的代謝消耗物質(zhì)較多，同時(shí)個(gè)體可利用的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)減少，導(dǎo)致總酸含量降低[11、13、14]。

2.3 發(fā)酵溫度對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的影響

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的影響

由圖3表明，發(fā)酵溫度對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中的總酸含量有一定的影響作用。隨松針醋醋酸發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵過(guò)程中的總酸含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵溫度在30℃～36℃時(shí)，隨發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵過(guò)程中的總酸含量明顯增加。發(fā)酵溫度達(dá)到36℃時(shí)總酸含量最高，約為6.60 g·100 mL-1；當(dāng)發(fā)酵溫度高于36℃后，隨醋酸發(fā)酵溫度升高，松針醋的總酸含量逐漸降低。這可能由于發(fā)酵溫度過(guò)高或過(guò)低，均不利于醋酸菌的生長(zhǎng)和代謝，導(dǎo)致產(chǎn)酸量降低[12、15、16]。

2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的影響

由圖4可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量有一定的影響。隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，松針醋的總酸含量逐漸上升。發(fā)酵的初期，總酸含量迅速增加，待發(fā)酵2d后，隨醋酸發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，松針醋總酸含量上升的趨勢(shì)明顯減弱。發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，菌體代謝旺盛，底物充足，導(dǎo)致總酸含量迅速上升；發(fā)酵后期，隨著底物不斷被消耗，產(chǎn)物抑制等因素的影響[17]。

2.5 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的影響

圖5 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的影響

由圖5可知，搖床轉(zhuǎn)速對(duì)松針醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量有一定的影響。當(dāng)轉(zhuǎn)速在100 ～120 r·min-1時(shí)，總酸含量隨轉(zhuǎn)速增加而升高，最高可達(dá)6.75 g·100 mL-1；此后隨搖床轉(zhuǎn)數(shù)的增加而降低，可能是因?yàn)榇姿峋呛醚蹙?，在發(fā)酵過(guò)程中適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速不僅有利于使底物更好地在發(fā)酵液內(nèi)轉(zhuǎn)移和發(fā)揮作用，而且溶氧效果好，但搖床轉(zhuǎn)速過(guò)高時(shí)，發(fā)酵液溶氧量過(guò)多產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，反而影響醋酸菌代謝進(jìn)而加速醋酸菌衰亡[18]。

2.6 松針醋醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化

根據(jù)前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以松針醋總酸含量為指標(biāo)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L9(34)，優(yōu)化松針醋醋酸發(fā)酵工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見(jiàn)表1。

由表1可知，影響總酸含量的主次順序?yàn)镃>B>A>D，即發(fā)酵溫度>初始乙醇含量>菌種添加量>發(fā)酵時(shí)間，且根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，最佳組合為A2B2C2D3，即當(dāng)初始酒精含量10%、菌種添加量0.4%、發(fā)酵條件(3.5 d、36℃)時(shí)。利用最佳工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得松針醋總酸含量達(dá)到6.93 g·100 mL-1。

表1 松針醋醋酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)正交表

3 結(jié)論

(1)在松針醋加工過(guò)程中，發(fā)酵液的初始乙醇含量、菌種添加量、發(fā)酵溫度、醋酸發(fā)酵時(shí)間和搖床轉(zhuǎn)數(shù)均對(duì)松針醋的總酸的含量有一定的影響座作用。(2)在松針醋加工過(guò)程中，當(dāng)發(fā)酵液初始乙醇含量為10%、菌種添加量為0.4%、發(fā)酵條件(3.5 d、36℃)時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為120 r·min-1時(shí)，松針醋總酸含可達(dá)6.93 g·100 mL-1。